丹参总酚酸生物黏附漂浮微丸体外释放和大鼠药代动力学研究

杨丹丹　黎迎　朱春燕

摘要：目的 制备丹参总酚酸生物黏附漂浮微丸，延长其在体内的滞留时间，提高其口服生物利用度。方法 采用挤出滚圆法，分别以壳聚糖、羟丙基甲基纤维素（HPMC）和卡波姆为黏附材料，十八醇为漂浮材料，微晶纤维素为成型剂，制备丹参总酚酸黏附漂浮微丸。考察制备的2种黏附漂浮微丸的体外释放及其在大鼠体内生物利用度。结果 体外释放试验结果表明，空白微丸中丹酚酸B在4 h即释放完全，而制备的2种黏附漂浮微丸的体外释放时间达12 h。大鼠体内药代动力学研究结果表明，大鼠分别灌胃丹参总酚酸原料药、丹参总酚酸壳聚糖微丸、丹参总酚酸HPMC微丸后，丹酚酸B在大鼠体内Tmax分别为（12.00±2.74）min、（17.00±7.58）min、（27.00±12.55）min，丹参总酚酸壳聚糖微丸、丹参总酚酸HPMC微丸相對生物利用度分别为177.08%、172.03%。结论 丹参总酚酸黏附漂浮微丸在体外释放缓慢，黏附漂浮微丸可延长药物在体内的滞留时间，提高丹参总酚酸在大鼠体内的口服生物利用度。

关键词：丹参总酚酸；生物黏附漂浮；微丸；体外释放；药代动力学

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.019

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）06-0077-05

Study on in Vitro Release of Salvianolic Acid Bioadhesive Floating Pellets

and Pharmacokinetics in Rats

YANG Dan-dan， LI Ying， ZHU Chun-yan

Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Beijing 100193， China

Abstract： Objective To prepare salvianolic acid bioadhesive floating pellets； To prolong its residence time in vivo； To improve the oral bioavailability. Methods Salviae miltiorrhizae total phenolic acid adhering floating pellets were prepared by extrusion-spheronization. Chitosan， HPMC and carbomer were used as adherent material， stearyl alcohol was used as floating material and MCC as forming agent. The in vitro release of two adherent floating pellets were prepared and their bioavailability in rats were investigated. Results The results of in vitro release test showed that the salvianolic acid B in the blank pellets was completely released at 4 h， and the two adherent floating pellets prepared in vitro were released for 12 h. The results of pharmacokinetic studies in rats showed that after intragastric administration of salvianolic acid， salvianolic acid chitosan pellets and salvianolic acid HPMC pellets， Tmax were （12.00±2.74）min， （17.00±7.58）min and （27.00±12.55）min， respectively. The relative bioavailability of salvianolic acid chitosan pellets and salvianolic acid HPMC pellets were 177.08% and 172.03%， respectively. Conclusion Salvia total phenolic acid adherent floating pellets release slowly in vitro， and floating pellets can prolong the retention time in vivo and increase the oral bioavailability of salvianolic acid in rats.

Keywords： salvianolic acid； bioadhesive floating； pellets； release in vitro； pharmacokinetics

丹参为唇形科鼠尾草属丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，又名大红袍、红根赤参、血丹参等，始载于《神农本草经》，其活性成分主要分为两大类，即脂溶性成分和水溶性成分。丹参总酚酸是丹参的水溶性提取物[1]，其中以丹酚酸B含量最高。

本课题组在前期对丹参总酚酸理化性质的考察中发现，丹参总酚酸主要成分丹酚酸B的油水分配系数与pH值呈负相关，在胃部pH值条件下的油水分配系数明显高于在肠中。油水分配系数越高越有利于药物的跨膜转运。并且丹参总酚酸为酸性物质，其在酸性条件下最稳定。本课题组前期筛选出菠萝叶提取物和葛根总黄酮生物黏附漂浮微丸的最佳处方，体内外研究表明，制备的菠萝叶提取物和葛根总黄酮黏附漂浮微丸具有良好的胃滞留效果和缓释特性，达到了提高药物口服生物利用度的目的[2-4]。因此，本研究将菠萝叶提取物和葛根总黄酮黏附漂浮微丸的最佳处方应用于丹参总酚酸，制备2种丹参总酚酸黏附漂浮微丸，延长丹参总酚酸在胃肠道的滞留时间，改善药物吸收，从而提高生物利用度。

1 仪器、试药与动物

LC-10AT高效液相色譜仪（日本岛津），包括SPD-10AVP紫外检测器、SCL-10AVP控制器、CTO-10ASV柱温箱、CLASS-VP工作站；MBS-120挤出滚圆机（英国Caleva公司）；盘式干燥烘箱（英国Caleva公司）；HH. SY11-Ni2B电热恒温水浴锅（北京长风仪器仪表公司）；RC806D溶出试验仪（天津市天大天发科技有限公司）；BSA 224S-CW型天平（德国Sartorius公司）；UGC-12MF氮吹仪（北京优晟联合科技有限公司）。

丹参总酚酸提取物（西安小草植物科技有限公司，批号XC20170112），丹酚酸B对照品（上海融禾医药科技有限公司，批号160928，HPLC纯度≥98%），对香豆酸对照品（美国Sigma公司，批号1001108036，HPLC纯度≥98%），壳聚糖（CTS，美国Sigma公司，CAS9012-76-4），卡波姆934P（美国BF Goodrich公司），十八醇（北京化学试剂公司），微晶纤维素PH-101（MCC，上海源叶生物科技有限公司），羟丙基甲基纤维素（HPMC K4M，美国卡乐康公司），盐酸、甲醇、乙腈（美国Fisher公司，色谱级），其余试剂均为分析纯。

SPF级6周龄SD雄性大鼠15只，体质量（220±20）g，北京市维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号SDXK（京）2015-0001，饲养于中国医学科学院药用植物研究所SPF级动物房。

2 方法与结果

2.1 丹酚酸B体外测定方法

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流动相：甲醇∶乙腈∶水（含0.3%磷酸）=30∶10∶60；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：286 nm；进样量：20 ?L。

2.1.2 线性关系考察

取丹酚酸B对照品2.54 mg，精密称定，置于25 mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL置于5 mL量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，用0.45 ?m微孔滤膜过滤，分别取对照品溶液20 ?L注入高效液相色谱仪，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作标准曲线，得丹酚酸B回归方程：Y=23 346X-11 043，r2=0.999 9，线性范围为2.032～65.024 ?g/mL。

2.1.3 方法回收率考察

精密称取丹酚酸B适量，配制成2.032、16.256、65.024 ?g/mL低、中、高3个浓度的溶液，每个样品配制5份，按上述色谱条件进样检测，计算测得量，以实测值与理论值相比，计算方法回收率。结果在考察浓度范围内样品回收率在98%～102%之间，表明方法回收率良好。

2.1.4 方法精密度考察

配制2.032、16.256、65.024 ?g/mL低、中、高3个浓度的溶液，分别于日内重复测定5次，并连续测定5 d，求得日内、日间RSD。结果日内和日间精密度RSD均小于2%，表明精密度良好，符合体外分析方法要求。

2.2 微丸的制备方法

分别称取丹参总酚酸原料药、MCC、CTS、十八醇、HPMC、卡波姆，按等量递加法混匀，过80目筛，加润湿黏合剂不断捏合，制成软材。经挤出机筛板以35 r/min转速挤成直径相同、光滑致密的条状物；将条状物置于滚圆机内，1300 r/min滚圆5 min，直至滚制成丸；取出微丸，干燥，过筛，分别制得空白组微丸（MCC和丹参总酚酸原料药）、CTS组微丸和HPMC组微丸。

2.3 微丸产率的测定

采用筛分法，经挤出滚圆法制备的微丸干燥后取18～24目筛得到目标微丸，计算产率。产率（%）=目标微丸质量÷投料量×100%。壳聚糖组微丸产率为48.39%±1.02%，HPMC组微丸产率为50.98%±1.87%。

2.4 微丸体外释放度测定

参照2015年版《中华人民共和国药典》（四部）附录释放度测定方法转篮法：以脱气处理的0.1 mol/L盐酸900 mL为释放介质，转速50 r/min，温度（37±0.5）℃；精密称取微丸约0.9 g，分别于1、2、4、6、8、10、12 h取释放液2.0 mL，同时补加相应释放介质2.0 mL，过0.45 ?m滤膜，弃去初滤液，取续滤液，HPLC测定药物浓度，计算药物累积释放度。

2.4.1 微丸体外释放曲线

与空白组微丸比较，CTS组微丸和HPMC组微丸中丹酚酸B的体外释放无突释现象，释放速度明显减缓，在体外可持续释放12 h。见图1、图2。

2.4.2 药物释放模型的拟合

采用Excel2013软件进行数据分析。分别采用零级、一级、Higuchi和Ritger-Peppas方程对丹参总酚酸黏附漂浮微丸中丹酚酸B的体外释放曲线进行拟合，结果见表1、表2。可见，丹参总酚酸黏附漂浮微丸中丹酚酸B的释放曲线经一级释放方程拟合相关性最好。

2.5 血浆样品中丹酚酸B含量测定

2.5.1 色谱条件

同“2.1.1”项下色谱条件。

2.5.2 血浆处理方法

精密吸取200 ?L血浆，放入离心管中，加入内标对香豆酸20 ?L、2 mol/L盐酸30 ?L，涡旋振荡60 s，加入乙酸乙酯2 mL，涡旋振荡90 s，12 000 r/min离心5 min，吸取上清液，精密吸取上层有机溶剂，常温条件下氮气吹干，用甲醇100 ?L复溶，涡旋20 s，12 000 r/min离心5 min，取20 ?L上清液进样测定。

2.5.3 方法学考察

2.5.3.1 专属性考察

在上述色谱条件下，对空白血浆、空白血浆+丹酚酸B对照品及空白血浆+丹酚酸B对照品+内标对香豆酸分别进样检测，色谱图见图3。对香豆酸、丹酚酸B的出峰时间分别为9.5、12.9 min。内标与丹酚酸B色谱峰互不干扰，峰形良好，无杂峰干扰，基线平稳。

2.5.3.2 线性关系考察

取空白血浆200 ?L，加内标20 ?L，分别加不同浓度的丹酚酸B对照品标准液，按血浆处理方法，配成血浆中含0.25、0.5、1、2、4、8 ?g/mL的标准溶液。以丹酚酸B和对香豆酸峰面积比值为纵坐标，丹酚酸B血药浓度为横坐标，作标准曲线，得回归方程：Y=0.244 3X-0.007 2，r2=0.999 3，线性范围为0.25～8.0 ?g/mL。

2.5.3.3 精密度考察

取高、中、低浓度样品，连续测定5次以计算日内差异，连续测定5 d以计算日间差异。结果表明，样品低、中、高3个浓度的日间、日内精密度RSD均小于15%，符合生物样品分析方法的精密度要求。

2.5.3.4 回收率考察

取大鼠空白血浆，制备丹酚酸B低、中、高3个浓度样品，每个浓度配制5份，作为质控样品，进行HPLC分析。以提取后的色谱图峰面积与未经提取直接进样获得的色谱图峰面积之比考察样品提取回收率。结果表明，相对回收率在85%～115%之间，符合样品回收率要求。

2.6 微丸在大鼠体内药代动力学考察

取健康大鼠15只，分为丹参总酚酸原料药组、CTS组、HPMC组，每组5只，实验前禁食，颈静脉插管备用，次日按400 mg/kg丹参总酚酸原料药分别灌胃给予丹参总酚酸原料药、CTS微丸、HPMC微丸（采用自制大鼠微丸灌胃装置，保证微丸以完整剂型到达大鼠胃部）。分别于给药后5、10、15、30、45、60、90、120、180、240、360、480 min及12、24 h于颈静脉取血0.5 mL，肝素钠抗凝，立即以13 000 r/min离心5 min，分离出血浆，冷藏，备用。

采用WinNolin6.0数据统计软件分别计算参比制剂和试验制剂中丹酚酸B的Tmax、Cmax、AUC0→t等药代动力学参数。大鼠口服丹参总酚酸原料药及2组黏附漂浮微丸的药代动力学参数见表3。结果表明，制备的黏附漂浮微丸与原料药相比，生物利用度CTS组为177.08%，HPMC组为172.03%；达峰时间得到延长，制备的黏附漂浮微丸表现出一定的缓释和促吸收作用。各组浓度-时间曲线见图4。

3 讨论

微丸为多单元给药系统，与片剂、胶囊剂等单元剂型相比，可以避免单元系统控制不好时引起药物的突释。胃滞留剂型通过驻留制剂在胃中长时间释放药物，药物一部分被胃吸收或在胃内发挥作用，另一部分通过幽门喷入小肠再吸收。将药物滞留在胃中可以延长其在整个胃肠道的转运时间，因而可改善药物的生物利用度[5]。

本研究在制備微丸中选择以CTS、HPMC、卡波姆为主要黏附性材料。CTS具有独特的生理和化学特性，具有良好的生物黏附性、黏膜吸收促进性、生物相容性及生物可降解性，且在酸性条件下易溶解，是一种优良的生物黏附材料；HPMC除发挥生物黏附作用外，还是亲水凝胶材料，在遇到胃液后形成一层胶体屏障，一方面可以维持制剂密度低于胃液，保持漂浮性，另一方面使药物缓慢扩散至表面而溶于介质，使释药时间延长，从而使制剂具备良好的骨架缓释作用；卡波姆934P作为高分子材料，分子中含有羧基或羟基，遇水后与黏膜糖蛋白分子相互缠结而维持长时间的生物黏附作用，起到定位给药的作用[6-7]。

普通的胃漂浮制剂经口给药后必须一直保持胃内容物的含量，患者应尽可能多饮水使制剂漂浮在胃内，否则将会被胃排空[8]。普通生物黏附经口给药制剂当胃内充满液体及其他内容物时，因不能与黏膜接触而无法起到黏附作用；若黏附在胃黏膜后，胃内充满食物并蠕动时或胃黏膜不断更新脱落及胃内pH值变化时，制剂也会脱离胃黏膜而被胃排空[9-11]。本课题组设计的生物黏附漂浮微丸，微丸的黏附、漂浮协调作用，可以克服经口给药后胃漂浮制剂或生物黏附制剂分别单独存在时的缺点，制剂既能在胃液充盈时漂浮，又可在胃液稀少时黏附于胃黏膜上，从而真正延长药物在胃部的滞留时间。

与HPMC组微丸相比，CTS组微丸生物利用度较高，推测可能与CTS促进药物吸收有关，而HPMC组Tmax值较高，药物的缓释效果较好，推测与HPMC作为亲水凝胶骨架材料起缓释作用的机制有关。

本试验的2种处方为本课题组研究的其他酚酸类物质的最优处方，在一定程度上使药物实现了缓慢释放，提高了口服生物利用度，但用于制备丹参总酚酸黏附漂浮微丸还有待改进，下一步可以采用包衣技术使缓释效果进一步改善。

参考文献：

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[4] 黎迎，宋轶群，朱春燕，等.葛根总黄酮生物黏附漂浮微丸体外Caco-2细胞转运和体内生物利用度评价[J].药学学报，2016，51（7）：1144- 1149.

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[11] 陈静，屠锡德.生物粘附性给药系统的研究[J].药学进展，2000， 24（2）：65-68.

（收稿日期：2017-12-07）

（修回日期：2017-12-22；编辑：陈静）