乌三金洗剂质量标准研究

时间：2024-05-14

李德林张子侠

【摘要】目的：建立乌三金洗剂的质量标准。方法：薄层色谱法（TLC）对乌三金洗剂处方中黄柏、苦参、大黄、蛇床子及土荆皮进行定性鉴别;高效液相色谱法（HPLC）对乌三金洗剂中蛇床子素含量进行测定研究。以Wonda Cract ODS2（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱;以乙腈-水（70∶30）为流动相;检测波长为322 nm;柱温设置30 ℃;流速设置1.0 mL/min。结果：黄柏、苦参、大黄、蛇床子及土荆皮薄层鉴别专属性强，特征斑点清晰，且阴性对照无干扰，可作为乌三金洗剂的定性鉴别。蛇床子素在12.63～252.60 μg范围内与峰面积呈较好的线性关系，回归方程为Y=0.0606X-0.0062（r=0.9999），平均回收率为96.45%，RSD=0.93%（n=6）。结论：该法操作准确、简便，专属性强、稳定性及重复性良好，可有效控制乌三金洗剂的质量。

【关键词】乌三金洗剂;质量标准;色谱法;高压液相;蛇床子素

【中圖分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）24-0035-06

Study on Quality Standard of Wusanjin Lotion

LI Delin ZHANG Zixia

Taihe Traditional Chinese Medicine Hospital，Taihe 236600，China

Abstract：Objective To establish the quality standard of Wusanjin Lotion.Methods The contents of Cortex Phellodendri，Radix Sophorae Favescentis，Radix et Rhizoma Rhei，Cnidii Fructus and Cortex Pseudolaricis in Wusanjin Lotion were identified by TLC method. The contents of osthol in Wusanjin Lotion were determined by HPLC method. This method was employed on an Wonda Cract ODS2 column （4.6 mm×250 mm，5 μm） at 30 degrees Celsiu with a mobile phase consisting of acetonitrile-water （70∶30） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 322 nm.Results TLC spots of Cortex Phellodendri，Radix Sophorae Favescentis，Radix et Rhizoma Rhei，Cnidii Fructus and Cortex Pseudolaricis were clear and negative without interference，which can be used as method. which can be used as qualitative method. The contents of osthol had good linearity within the ranges of 12.63 μg～252.60 μg and equation was Y=0.0606X-0.0062（r=0.9999），The average recovery of osthol was 96.45% and RSD was 0.93%（n=6）.Conclusion The method was simple，accurate，with good specificity and reproducibility，and can be used for the quality of Wusanjin Lotion.

Key words：Wusanjin Lotion; Quality Standard; Chromatography; High Pressure Liquid; Osthol

带下病是目前临床发病率较高且难以治愈的妇科疾病之一，西医中的阴道炎、宫颈炎、盆腔炎性等疾病均属于此范畴，该病具有慢性缠绵且易复发的特点，给广大女性身心健康带来了很大的困扰[1]。因此，寻找有效、持久、低毒的治疗女性带下病药物十分必要。现代基础及临床研究[2]表明，中医药在治疗女性带下病上不仅疗效显著，且作用持久不易复发，适合长期使用。乌三金洗剂由乌梅、土荆皮、黄柏、大黄及苦参等十味中药组成，功能除湿祛毒、杀虫止痒。处方遵照中医理论，结合多年临床经验，提出“虫邪外感、湿热蕴结”，是从“湿”“毒”“虫”着手来研究揭示“带下病”的一般病机规律，采取辨病与辩证的方法，针对湿毒蕴肤型皮肤黏膜疾病所拟定的方剂。本制剂在我院已应用多年，临床效果较好，然而尚缺乏有效的质量控制方法，为了更好的保证制剂质量及临床用药的安全性和有效性，本研究采用TLC法对乌三金洗剂中黄柏、苦参、大黄、蛇床子及土荆皮进行定性鉴别研究，并采用HPLC法对乌三金洗剂中蛇床子素含量进行测定。

1 仪器与材料

1.1 仪器 XSE105DU型十万分之一电子天平（梅特勒-托利多）;Ultimate 3000型高效液相色谱仪（赛默飞）;PHS-2F型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）;ZF-2型三用紫外仪（上海市安亭电子仪器厂）;DHG-9055A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）;HH-S4型数显恒温水浴锅（常州国宇仪器制造有限公司）;KQ-300DE型数控超声波清洗器（上海杰理科技有限公司）。

1.2 试药大黄对照药材（批号：120984-201202）、盐酸小檗碱（批号：110713-201613）、蛇床子素（批号：110822-201609）、苦参碱（批号：110805-200508）、土荆皮乙酸对照品（批号：110880-201604）等均购自中国食品药品检定研究院。乌三金洗剂（规格：每瓶250 mL，本院中药制剂室自制，批号：20170824，20170825，20170826）。蛇床子、黄柏、乌梅、大黄等十味中药均购自于安徽守正中药饮片有限公司，并经本院马德强主任中药师鉴定，均符合2015年版《中国药典》一部及2019年版《安徽省中药饮片炮制规范》要求;乙腈为色谱纯，水为纯化水，甲醇、乙醚、乙酸乙酯等其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

2.1.1 黄柏取乌三金洗剂10 mL，加甲醇10 mL超声处理20 min，离心，取上清液作为供试品溶液[3-4];另取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1毫升含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液;再按乌三金洗剂制备工艺生产不含黄柏的样品，同法制得缺黄柏阴性对照溶液。照TLC法（中国药典2015年版四部通则0502）试验，吸取上述三种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G板上，以正丁醇-冰醋酸-水（6∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品溶液色谱中，在与盐酸小檗碱对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，斑点清晰可见，分离效果较好，阴性无干扰，专属性较好，三批乌三金洗剂均检出黄柏。结果如图1所示。

2.1.2 苦参取乌三金洗剂10 mL，滴加浓氨水将溶液pH调至10～11，氯仿振摇提取3次，每次15 mL，合并提取液，水浴蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，即得供试品溶液[5-6];另取苦参碱对照品适量，加甲醇制成每1毫升含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液;再按乌三金洗剂制备工艺生产不含苦参的样品，同法制得缺苦参阴性样品溶液。照TLC法（中国药典2015年版四部通则0502）试验，吸取上述三种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G板上，以环己烷-丙酮-乙酸乙酯-浓氨试液（2∶3∶4∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液并吹干。结果供试品溶液色谱中，在与苦参碱对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的橘红色斑点，斑点清晰可见，分离效果较好，且阴性对照无干扰，专属性较好，三批乌三金洗剂均检出苦参。结果如图2所示。

2.1.3 大黄取乌三金洗剂10 mL，加盐酸1 mL，加热回流30 min，立即冷水冷却至室温，以无水乙醚提取2次，每次20 mL，合并提取液，蒸干，残渣加氯仿1 mL使溶解，即得供试品溶液[7-8];另取大黄对照药材0.1 g，加甲醇20 mL，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL使溶解，余下同供试品溶液制备方法，作为对照药材溶液;再按乌三金洗剂制备工艺生产不含大黄的样品，同法制得缺大黄阴性对照溶液。照TLC法（中国药典2015年版四部通则0502）试验，吸取上述三种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G板上，以甲酸乙酯-石油醚（30～60 ℃）-甲酸（5∶15∶1）上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品溶液色谱中，在与大黄对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，置氨蒸气熏后，斑点变为红色，清晰可见，且阴性样品无干扰，专属性较好，三批乌三金洗剂均检出大黄。结果如图3所示。

2.1.4 蛇床子取乌三金洗剂20 mL，用无水乙醚振摇萃取2次，每次30 mL，乙醚层合并，加入10 mL碳酸氢钠饱和溶液振摇提取，乙醚层蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，即得供试品溶液[9-10];另取蛇床子素对照品适量，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液;再按乌三金洗剂制备工艺生产不含蛇床子的样品，同法制得缺蛇床子阴性对照溶液。照TLC法（中国药典2015年版四部通则0502）试验，吸取上述供试品及阴性对照溶液各10 μL，对照品溶液5 μL，以正己烷-乙酸乙酯（17∶4）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，斑点清晰可见，分离效果较好，且阴性对照无干扰，专属性较好，三批乌三金洗剂均检出蛇床子。结果如图4所示。

2.1.5 土荆皮取乌三金洗剂30 mL，浓缩至稠，加硅胶（100-200目）5 g拌匀，干燥至干，研匀，加乙醚30 mL超声30 min，滤过，取滤液，用5%碳酸氢钠溶液30 mL提取，取碳酸氢钠溶液，滴加稀盐酸调pH为1～2，以乙醚30 mL提取，乙醚提取液用水10 mL洗涤，取乙醚层，水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，即得供试品溶液[11];另取土荆皮乙酸对照品适量，加甲醇制成每1毫升含1 mg的对照品溶液。再按乌三金洗剂制备工艺生产不含土荆皮的样品，同法制得缺土荆皮阴性对照溶液。照TLC法（中国药典2015年版四部通则0502）试验，吸取上述供试品及阴性对照溶液各10 μL，对照品溶液5 μL，以石油醚（30-60 ℃）-三氯甲烷-冰醋酸（6∶10∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以4%香草醛乙醇溶液-20%硫酸溶液（1∶1，临用前混合）的混合溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。结果供试品溶液色谱中，在与土荆皮乙酸对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，斑点清晰可见，分离效果较好，且阴性对照无干扰，专属性较好，三批乌三金洗剂均检出土荆皮。结果如图5所示。

2.2 蛇床子素HPLC含量测定

2.2.1 色谱条件色谱柱：岛津Wonda Cract ODS2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：乙腈-水（70∶30）;流速：1.0 mL/min;柱溫设置为30 ℃;检测波长为322 nm;理论塔板数按蛇床子素峰计应不得低于3000，进样量为10 μL。

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 对照品溶液的制备取蛇床子素对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1毫升含12.63 μg的蛇床子素对照品溶液，摇匀，即得。

2.2.2.2 供试品溶液的制备精密吸取本品25mL，用乙酸乙酯振摇提取4次，每次25 mL，合并乙酸乙酯提取液，乙酸乙酯提取液置水浴上蒸干，残渣加乙醇适量溶解，转移至25 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，即得[12-13]。

2.2.2.3 阴性对照溶液的制备按乌三金洗剂处方和制备工艺制备缺蛇床子的阴性样品，再按“2.2.2.2”项下方法制备缺蛇床子阴性对照溶液。

2.2.3 专属性试验按“2.2.1”项下色谱条件，分别吸取上述供试品溶液、蛇床子素对照品溶液和阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪中，记录各自色谱图。结果供试品色谱中，在与对照品色谱相同的保留时间内出现蛇床子素色谱峰，且蛇床子素分离度及拖尾因子均符合要求，而阴性对照无干扰，故该法专属性良好。结果如图6所示。

2.2.4 线性关系考察取“2.2.2.1”项下的蛇床子素对照品溶液适量，置自动进样器中，分别吸取1、2、5、10、15、20 μL于液相色谱仪中，再按上述“2.2.1”项下色谱条件进样，并记录峰面积。并以蛇床子素对照品进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归。结果得蛇床子素的回归方程为：Y= 0.0606X- 0.0062（r=0.9999），以上结果表明蛇床子素在进样量为12.63 ～ 252.60 μg范围内呈现良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验取“2.2.2.1”项下蛇床子素对照品溶液适量，置自动进样器中，按“2.2.1”下的色谱条件，连续进样6次，测定蛇床子素峰面积。结果蛇床子素平均峰面积为6.539，RSD为0.26%（n=6），说明该仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验精密吸取乌三金洗剂（批号：20170824）25 mL，按“2.2.2.2”下制备方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件，将供试品溶液置于自动进样器中，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，并记录蛇床子素峰面积，结果蛇床子素平均峰面积为7.814。RSD为0.11%（n=6），表明乌三金洗剂供试品溶液在室温放置24 h内较为稳定。

2.2.7 重复性试验精密量取同一批次的乌三金洗剂6份（批号：20170824），每份25 mL，按上述“2.2.2.2”项下供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，置于自动进样器中，再按上述“2.2.1”项下色谱条件进样，测定蛇床子素峰面积。结果蛇床子素平均峰面积为7.762，RSD为0.56%（n=6）。表明该方法重复性较好。

2.2.8 加样回收率试验精密量取已知含量的乌三金洗剂6份（批号：20170824），每份12.5 mL，分别精密加入蛇床子素对照品适量，按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，置于自动进样器中，再按上述“2.2.2.1”项下色谱条件，测定蛇床子素峰面积并计算其蛇床子素加样回收率。结果6份样品的平均回收率为96.45%，RSD为0.93%（n=6）。表明样品回收率良好，该法准确度较高。

2.2.9 样品含量测定及含量限度的确定通过投料前对蛇床子药材中蛇床子素含量测定，以及生产的成品中蛇床子素的含量比较，计算得到该工艺蛇床子素的转移率。结果表明，蛇床子饮片中蛇床子素含量为2.94 %，根据处方换算，乌三金洗剂中蛇床子素的理论含量为1.0584 mg/mL，即制成制剂后每毫升含蛇床子素为1.0584 mg。实际生产中，批号为20170824、20170825、20170826三批樣品中蛇床子素的含量分别为12.84 μg/mL、12.67 μg/mL、12.65 μg/mL，转移率分别为1.21%、1.20%、1.19%，平均转移率为1.20%。根据中国药典2015年版一部规定：蛇床子饮片中蛇床子素的含量不得少于1.0%，因此，制成制剂后含量限度确定为：每毫升含蛇床子以蛇床子素（C15H16O3）计，不得少于4.32 μg，三批样品所测得含量，每毫升含蛇床子素均高于4.32 μg。结果见表1。

3 讨论

3.1 薄层鉴别黄柏薄层鉴别时，参考相关文献[14-15]，同苦参处理方法，将样品碱化后用氯仿提取，结果显示样品主斑点虽较为清晰，但阴性样品在与对照品溶液色谱处有微弱干扰，考虑到此法在提取亲脂性生物碱的同时，也带来亲脂性杂质，遂改用醇类溶剂提取法，采用甲醇直接超声，结果斑点清晰，阴性无干扰，且该法更为简单。苦参薄层鉴别时，以丙酮-甲苯-甲醇（3 ∶8∶0.5）为展开剂，再以乙酸乙酯-甲苯-甲醇-水（4∶2∶2∶1）上层溶液为展开剂，结果斑点虽较为清晰，阴性无干扰，但操作较为复杂，且甲苯对环境及人体的健康危害较大，故改用乙酸乙酯-环己烷-丙酮-浓氨试液（4∶2∶3∶0.2）为展开剂，效果较为理想。此外，本研究还对方中乌梅、百部、地肤子及花椒等药味进行了薄层鉴别研究，结果发现百部及地肤子阴性对照有干扰，花椒及乌梅因主要含有挥发性成分，本制剂在传统水提工艺下，尚不能对两者挥发性成分充分提取，故与对照药材相比，主斑点较不清晰，暂未纳入乌三金洗剂质量标准。

3.2 提取方法的优化因蛇床子在方中作为君药，蛇床子素作为蛇床子药材中含量最高且主要药理活性成分，有研究[16]报道其具有较好的止痒、抗菌及增强免疫功能等作用，可治疗阴道炎及外阴湿疹等妇科疾病，与乌三金洗剂的主要功效尤为相似，故本研究拟将其作为乌三金洗剂HPLC测定的指标性成分。蛇床子素属于香豆素类化合物，文献报道[17-18]，蛇床子及其制剂中蛇床子素中的提取方法有乙酸乙酯萃取、乙醚萃取及甲醇超声提取等。研究前期曾对以上方法进行了比较，结果发现以乙酸乙酯萃取提取率较高，并对萃取次数进行了考察，结果显示乙酸乙酯萃取4次蛇床子素含量较萃取3次高，而与萃取5次相差不大，说明萃取4次可提取完全，故本研究以乙酸乙酯萃取4次作为蛇床子素的最佳提取方法。

3.3 流动相和色谱柱的考察乌三金洗剂为中药复方制剂，方中干扰成分较多，流动相的优化和色谱柱的选择对样品的分离有着重要的影响。研究曾参考相关文献对甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液及乙腈-水进行了考察。结果发现有机相为乙腈时，理论塔板数较甲醇高，且出峰时间较短，无机相为水或磷酸水溶液对峰形影响不大。此外，研究又对不同品牌的色谱柱（Thermo Syncronis C18、Hypersil ODS2及Wonda Cract ODS2）进行比较，结果发现Thermo Syncronis C18柱上蛇床子素分离度较差，Wonda Cract ODS2较Hypersil ODS2出峰时间短且分离效果较好。故本研究选择以乙腈-水溶液和Wonda Cract ODS2柱作为最佳流动相和色谱柱。

综上所述，研究建立的黄柏、苦参、大黄、蛇床子及土荆皮的TLC阴性对照无干扰、斑点清晰且专属性较强。蛇床子素的HPLC含量测定方法简便易行，重现性较好，为控制和评价乌三金洗剂的质量提供科学依据。然而由于受条件限制，本实验仅涉及单一成分的含量测定，还不能从整体上完全反映乌三金洗剂的内在质量，故下一步本研究拟采用指纹图谱技术对该制剂进行深层次的探究，以建立起更完整的质量控制标准。

参考文献

[1]李楠. 带下病的病因病机及临床研究进展[J]. 内蒙古中医药，2017，36（12）：144-145.

[2]韩云鹏，吴中秋，张敏. 带下病的中医认识和现代研究进展[J]. 江西中医药，2017，48（1）：70-72.

[3]张庆莲，黄娟，皮凤娟，等. 硝矾洗剂薄层色谱鉴别及微生物限度检查法的建立[J]. 西北药学杂志，2017，32（6）：722-725.

[4]张慧月，赵妹，赵雪梅. 祛湿止痒洗剂的定性定量方法研究[J]. 药物分析杂志，2017，37（5）：903-910.

[5]姜世贤，雷莉，顾莹. 杀虫止痒洗剂质量标准研究[J]. 陕西中医，2008，29（9）：1233-1234.

[6]程洪兵，李寒冰，张跃文，等. 八味大青叶洗剂质量标准研究[J]. 吉林中医药，2018，38（7）：832-835.

[7]沈烨，曹桂萍. 清热合剂的质量新标准研究[J]. 海峡药学，2017，29（3）：76-79.

[8]刘建清，王庆芬，曹毅祥，等. 复方茵陈合剂质量标准的建立[J]. 中国药师，2016，19（4）：790-792.

[9]国家药典委員会. 中华人民共和国药典（一部） [M]. 北京：中国医药科技出版社，2015：1734-1735.

[10]柳克浩，秦丽华. 平痒洗剂质量标准研究[J]. 亚太传统医药，2017，13（4）：23-26.

[11]陶来东. 止痒酊白鲜皮土荆皮的薄层鉴别[J]. 安徽医药，2010，14（9）：1028-1029.