紫外分光光度法测定溶血率的研究

程宾+张红宇+王莉+杨崇仪+赵祎

【摘 要】 目的：对紫外分光光度法测定吸收度计算溶血率时波长的选择进行探讨研究。方法：参考《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅧ B中药注射剂安全性检查法应用指导原则和中药、天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则进行溶血试验的研究。结果： 兔血红细胞破裂后在541nm和576nm处有最大吸收；同一供试品分别采用541mm和576nm测定溶血率，结果无显著性差异。结论：当样品本身在541nm或576nm处有吸收，干扰溶血率计算时可选择另一不干扰波长测定溶血率。

【关键词】 紫外分光光度法；溶血率；波长

【中图分类号】R927.11 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）24-0031-03

Abstract：Objective To study the selection of wavelength when UV is used on the hemolytic rate. Methods According to the Guiding Principles of safety tests on traditional Chinese medicine injection in Annex XVIII B， Chinese Pharmacopoeia， 2010 Edition 1， and Technical Guidelines of studies on the irritability and hemolytic activity of traditional Chinese medicine and natural medicine. Results When rabbit red blood cells rupture， there is maximum absorption on 541 nm and 576 nm. There is no significant difference when a same sample was determined on 541 nm or 576 nm and calculate hemolytic rate. Conclusion When a sample have absoption on 541 nm or 576 nm and it interfere in hemolytic rate，we can choose another wavelength to determine the hemolytic rate.

Keywords：Ultraviolet Spectrophotometry；Hemolytic Rate； Wavelength

溶血与凝聚是灭菌制剂安全性质量控制指标之一，随着国家对注射剂安全性的重视程度日渐增加，尤其是中药注射剂，溶血与凝聚已成为安全性必检项目之一。《中国药典》2005年版、2010年版均收载了该方法，但在结果判断中，药典一直以肉眼目测作为样品是否溶血的结果判断方法。在“中药、天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则”中收载了紫外分光光度法测定吸收度计算溶血率以判断样品是否溶血的方法，该指导原则中仅收载了545nm作为测定波长，但有部分注射剂，尤其是中药注射剂可能本身在545nm有吸收，可造成对样品溶血率测定的干扰。因此，笔者对紫外分光光度法测定溶血率时波长的选择进行了以下研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器 SUB28恒温水浴（Grant Instrument Ltd. England）；TLM16M型高速冷冻离心机（湘仪离心机厂）；LD4-2离心机（北京医用离心机厂）；UV-2550 PC型紫外分光光度计（岛津仪器）；DHG-9075 A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 材料 血塞通注射液（批号：08082413；黑龙江多多药业有限责任公司）。氯化钠注射液（批号：A100205p2，昆明南疆制药有限公司）。

1.3 实验动物 普通级日本大耳白兔由昆明医学院实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK[滇]2005-0008，发证机关：云南省科学技术厅；实验动物使用许可证：SYXK（滇）2005—0005，发证机关：云南省科学技术厅。

2 方法与结果

2.1 兔血红细胞溶血后最大吸收波长的测定

2.1.1 2%红细胞混悬液的配制[1] 兔心脏取血4mL，用玻璃珠去纤维蛋白原使成脱纤血，加氯化钠注射液，摇匀，离心15min（1000r/min），弃上清液，沉淀的的红细胞用氯化钠注射液同上法洗涤3次，至上清液不呈红色，取沉淀红细胞1mL，加氯化钠注射液稀释至50mL，混匀，即为2%红细胞混悬液供用，用时混匀。

2.1.2 试验方法 取上述2%红细胞混悬液2.5mL，分别加2.5mL氯化钠注射液作为阴性管，加2.5mL蒸馏水作为阳性管，混匀，于37℃温育，3h后取出，离心5min（1000r/min），在300～600nm进行紫外分光光度法测定，测得最大吸收峰所在波长。取性别、体重不同的10 只家兔心脏血重复上述实验，对实验结果进行统计学处理。

2.1.3 试验结果 阳性管与阴性管在300～600nm进行紫外分光光度法测定，阴性管无最大吸收，阳性管最大吸收峰所在波长见表1。

2.2 不同波长测定溶血率的比较

2.2.1 2%红细胞混悬液的配制 同“2.1.1 ”。

2.2.2 供试品溶液配制 取血塞通注射液用氯化钠注射液稀释制成20 mg/mL、10mg/mL、5mg/mL 3 个浓度作为供试液。

2.2.3 试验方法 每批次样品每浓度分别取洁净试管6 支，1、2号管为样品管，3、4号管为阴性对照管，5、6号管为阳性对照管，按表2所示，依次加入2%红细胞混悬液、氯化钠注射液或蒸馏水和相应浓度供试液，混匀，于37℃温育，3h后取出，离心5min（1000mg/mL，采用分光光度法（545nm和576nm）测定各管吸收度[2]。

2.2.4 试验结果 以两平行管吸收度平均值带入公试：溶血率（%）=（样品管-阴性管）/（阳性管-阴性管）×100 %，计算溶血率，重复试验，对相同浓度供试液在不同波长测定计算的溶血率进行统计学处理，与相同浓度供试液545nm相比，差异无统计学意义（P>0.05）结果见表3。

3 讨论

在查阅采用紫外分光光度法测定计算溶血率的相关资料中发现：不同实验者使用的波长不尽相同[3-5]，但实验3.1结果表明，取不同家兔心脏血，阴性管在300～600nm处均无最大吸收，说明在此波长范围内，兔血红细胞在不破裂发生溶血的情况下无可引起紫外-可见吸收的物质释放。血塞通注射液主要含三七总皂苷，一般来说，皂苷类成分仅在紫外区210nm或280nm有吸收，在可见区541nm和576nm并无吸收。而阳性管在541nm和576nm均有最大吸收峰，说明兔血红细胞破裂发生溶血后所释放的物质可引起此二波长的紫外吸收，选用性别、体重不同的家兔重复实验，说明不同家兔心脏血溶血后释放物质的紫外最大吸收峰所在波长范围稳定，无明显个体差异。

血塞通注射液为三七总皂苷制成的灭菌注射用水溶液，其主要成分具有溶血作用，因此，以不同浓度的血塞通注射液作为供试液，造成不同程度的溶血模型。采用545nm和576nm测定相同浓度血塞通注射液溶血管的溶血率，经统计学处理，无统计学差异，这说明选择545nm或576nm测定溶血率均可得到一致的结果，虽然对于血塞通注射液来说在可见区并无吸收干扰，但部分中药注射液本身在545nm处有紫外吸收，可能影响样品溶血率的测定计算，在此情况下可考虑采用576nm 作为测定波长。通过实验，笔者认为除中药、天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则中收载的溶血率测定波长545nm外，还可选择576nm作为测定波长或在实验中以阳性对照管所测得的最大吸收峰所在波长作为溶血率测定波长，这都是对该方法的有益补充和完善，也可扩大该方法在测定溶血率中的应用。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录132.

[2]中药、天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则[S].指导原则编号[Z] GPT4-1.

[3]韩立伟，李锦莲.紫外分光光度法测定中草药注射液的溶血度[J].黑龙江医药科学，2003，26（4）：84.

[4]邹静，张青，唐冰，等. 紫外分光光度法测定吐温80 对人红细胞和兔红细胞的溶血度[J].西南国防医药，2004，14（3）：255-256.

[5]周燕文，何淑华，莫武宁.中药注射液溶血度测定的3种方法比较[J].中国中药杂志，2002，27（6）：465-467.

（编辑：陶希睿）