归脾丸中黄曲霉毒素的测定及质量评价

杨 爽 马文静 高 婧 杨甲忠

（承德市食品药品检验检测中心 河北 承德 067000）

归脾丸[1]始载于宋代严用的《济生方》，由党参、炒白术、炙黄芪、炙甘草、茯苓、制远志、炒酸枣仁、龙眼肉、当归、木香和大枣（去核）11味药组成。具有益气健脾，养血安神的功效，用于心脾两虚，气短心悸，失眠多梦，头昏头晕，肢倦乏力，食欲不振，崩漏便血。现行质量标准为《中国药典》2015年版，设置的项目有性状、鉴别、检查、含量测定，并没有对黄曲霉毒素的限量检测方法。由于处方中含有炒白术、炒酸枣仁等多味药材易产生真菌毒素，故本文旨在研究归脾丸黄曲霉毒素测定方法，并应用于归脾丸的检测，进行质量评价。

1.仪器与试剂

1.1 Waters e2695高效液相色谱仪（沃特世有限公司）；MSS40S 分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；AG135分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）

1.2 黄曲霉毒素 乙腈为色谱纯（fish 有限公司）；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。

1.3 样品

市场上购买35批样品Y1-Y35，抽样涉及6个省及直辖市生产企业11家，批准文号14个。

2.方法与结果

2.1 色谱条

以十八烷基键合硅胶（5μm，4.6×250mm）为填充剂；柱温：40℃；以甲醇（A）-乙腈（B）-水（C）为流动相，流速1.1mL/min；采用光化学衍生法；光化学衍生器（254nm）；以荧光检测器检测，激发波长λex=360nm，发射波长λem=450nm。HPLC 梯度洗脱程序T：0 ～17 ～20 ～22 ～23min，A：10 ～10 ～10 ～10 ～10，B：25 ～45 ～65 ～65 ～25，C:65 ～45 ～25 ～25 ～65。进样量 ：对照品溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL，供试品溶液25μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密量取黄曲霉毒素对照品（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，标示浓度1.0μg/mL、0.3μg/mL、1.0μg/mL、0.3μg/mL）0.5mL，置10mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。精密量取储备液1mL,置25mL 量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品，精密称取水蜜丸9g，蜜丸15g，剪碎，置于均质瓶中，加入氯化钠3g，精密加入70%甲醇溶液75ml，超声处理15分钟使之分散均匀，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11000转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用玻璃纤维滤纸滤过，精密量取续滤液20ml，通过免疫亲和柱，流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液置2ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 测定法

按照2.1项下色谱条件测定，以混合对照品的峰面积为纵坐标，不同进样量为横坐标，绘制标准曲线。另测定供试品峰面积，从标准曲线中读出供试品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，计算，即得。

2.4 回收率

精密称取取Y1，3份各9g，剪碎，置于均质瓶中，加入氯化钠3g，精密吸取混合对照品储备液0.5mL 加入均质瓶中，按照2.2.2供试品溶液的制备，按照2色谱条件测定，计算回收率，分别为87.5%，90.1%，90.5%，符合要求。

2.5 结果

35批次样品中有8批次检出黄曲霉毒素，并经质谱验证。对照图谱见图1，样品图谱(检出）见图2、(未检出）见图3。检出数据见表1。

限度：按人体口服安全有效量制定，每1000g 含黄曲霉毒素B1不得过5μg，含黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2 和黄曲霉毒素B1的总量不得过10μg。

图1 黄曲霉毒素混合对照品HPLC图谱

图2 Y15（批号160901）HPLC图谱

图3 Y10（批号17031005）HPLC图谱

表1 8批次样品检出黄曲霉毒素数据表

结果：经检验，35次样品全部符合规定。

3.讨论

黄曲霉毒素(AFT)是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。黄曲霉毒素是主要由黄曲霉 (aspergillus flavus)寄生曲霉 (a.parasiticus)产生的次生代谢产物，在湿热地区出现黄曲霉毒素的机率最高。它们存在于土壤、动植物、各种坚果中，特别是容易污染花生、桃仁，酸枣仁等油性大的植物中，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡.以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。B1是最危险的致癌物，经常在玉米，花生，棉花种子，一些干果中常能检测到。它们在紫外线照射下能产生荧光，根据荧光颜色不同，将其分为B 族和G 族两大类及其衍生物。

本文采用中国药典中药材黄曲霉毒素的检查方法对成药归脾丸中黄曲霉毒素进行检查，回收率为87.3%，说明此方法稳定、准确，可以直接应用于归脾丸。

本文应用此方法对35批归脾丸黄曲霉毒素进行检查，结果有8批归脾丸检查出黄曲霉毒素，虽然都在人体中毒的限度内，但是有个别企业含量也偏高，而且同一厂家不同批号都含有黄曲霉毒素，要提高对个别企业的监管力度。相关标准有必要增加对黄曲霉毒素的检查，控制归脾丸的质量，提高人民的用药安全。