外周血let-7e-5p表达水平与缺血性脑卒中发病风险之间的关联性

罗澜 贺宇

摘要：目的 探讨外周血let-7e-5p表达水平与缺血性脑卒中发病风险的相关性。方法 将2018年4月～2019年4月在公安县人民医院就诊的缺血性脑卒中患者作为研究对象（观察组），对照组为在本院进行常规检查且年龄、性别满足研究标准者，使用实时定量PCR法测定患者外周全血let-7e-5p表达水平，深入剖析缺血性脑卒中患者miRNA表达水平与发病风险间的关联性。结果 外周全血let-7e-5p表达水平上升时，患者发病风险也会随之出现快速升高的情况，校正处理传统风险和血脂水平以后，依然与之存在着直接的联系。在模型Ⅰ里面，ROC曲线下，外周全血let-7e-5p表达水平的面积与传统危险因素的面积基本相同。纳入miRNA后，外周全血let-7e-5p表达水平的面积却出现了大幅度增加，表现出较强的差异性，且有统计学意义。结论 缺血性脑卒中发病风险与let-7e-5p表达水平之间存在著明显的关联。

关键词：let-7e-5p表达水平；缺血性脑卒中；关联性

缺血性脑卒中的基因调控作用受miRNA影响非常明显，如脑缺血再灌注、脑水肿以及动脉粥样硬化等[1]。表观遗传学取得的成绩非常显著，非编码小RNA（miRNA）所发挥的作用得到了业界的一致好评。对于miRNA来说，其大小能够满足25个核苷酸非编码RNA标准的要求，在剖析靶基因的3非编码区的过程中，使用的主要方式为碱基互补配方，有效指导了沉默复合体降解靶mRNA的翻译活动。

通过大量研究发现[2～4]，人类约1/3 基因的表达能够借助人类miRNA得以快速调节，高效调节了各种形式的生理状态和病理状态。在缺血性脑卒中患者病情不断地发展时，miRNA能够对其脑缺血再灌注、脑水肿、动脉粥样硬化等病理过程起到积极的基因调控作用。对缺血性脑卒中患者血液循环时，miRNA的表达水平进行客观检测，最终结论明确了循环miRNA能不能当做缺血性脑卒中的生物标志物[5]。

1资料与方法

1.1 一般资料

将2018年4月～2019年4月在公安县人民医院就诊的缺血性脑卒中患者作为研究对象（观察组），对照组为在本院进行常规检查且年龄、性别满足研究标准者，以上研究对象均为汉族，两组患者一般资料比较差异无统计学意义。两组患者调查表内容和生物样本非常完整。

以相关分类标准为依据对缺血性脑卒中患者进行诊断，患者症状与其保持比较稳定的关联性，各种症状和体征要与分类标准基本相同，持续时间保持在24 h以上，MRI或CT检查出现阳性改变时需将患有癌症史、冠心病史等患者排除在外。所有被选择的对照者都要经过全面的体质检查和病史问询，将存在神经系统疾病、癌症、心脏手术和脑卒中病史的患者排除掉。采用问卷调查法对病例一般情况进行调查，问卷中包括家族史、既往病史和一般情况等内容。所有研究对象中，现在吸烟指的是在过去一年中每天都会吸烟，至少1根以上。同时，分析血常规检验、生化检验等结果，在患者入院24 h内完成血液样本采集任务。

1.2 方法

抽取所有研究对象空腹状态下的肘静脉血5 ml，使用EDTA-K2抗凝管采血，在-80℃冰箱中进行全血储存备用，有效提取全血中的RNA。mirVanaPARIS miRNA的主要生产企业为美国Life Technologies公司，对每位研究对象抽取200 μl血进行检测。TaqMan miRNA逆转录试剂盒的生产企业为美国Life Technologies公司，完成对miRNA的逆转录，从而使逆转录得到快速、高效完成。0.05 μl的100 mmol/LdNTPs、5μl的反应体系、1.387 μl的无RNA酶水、1.67 μl的RNA、1μl的5x逆转录引物、0.063 μl的逆转录酶抑制剂、0.5μl的lOx逆转录缓冲液以及0.33 μl逆转录酶。稀释逆转录产物时，使用25 μl的无RNA酶水完成相关操作，TaqMan MiRNA检测试剂盒的主要生产企业为美国Life Technologies公司，开展PCR扩增，做到实时、定量。

PCR分体系构成情况：10 μl反应体系、4.5 μl的逆转录产物、0.5 μl的20xTaqMan miRNA探针和5 μl的TaqM an通用PCR反应液。计算miRNA的相对表达量时，主要使用-ΔCt法来完成，其公式为ΔCt=CtmiRNA-CtU6，内参基因为U6[6～7]。

1.3 观察指标

分析患者miRNA表达水平与缺血性脑卒中的关联性，以及miRNA作为分子生物标志物的可行性。

1.4 统计学分析

缺血性脑卒中分子标志物的曲线下面积主要使用受试者工作特征（ROC）曲线来开展全面分析，在对不同模型的曲线下面积进行对比时，使用的主要软件类型为Medcalc软件。使用重新分类分析法对miRNA的综合判别指数（IDI）和净重分类指数（NRI）进行分析。使用Spearman分析法对miRNA与临床指标间的相关性进行分析。

2结果

2.1 关联性

对照组外周全血let-7e-5p表达水平相对表达量为（4.06±1.22），观察组外周全血let-7e-5p表达水平的相对表达量为（4.98±1.06），观察组表达水平明显高于对照组，差异具有统计学意义（t=9.86，P＜0.01）。缺血性脑卒中患者发病风险与let-7e-5p表达水平存在直接的关系，及时校正血脂和危险因素进行后，缺血性脑卒中发病风险持续升高会给let-7e-5 p表达水平的增加带来直接的影响，具有统计学意义（OR=1.87，P＜0.01；OR=2.05；95%CI：167～2.42，P＜0.01）。见表1。

注：在模型1（传统危险因素的曲线下面积）中，miRNA是的自变量；在模型2中，miRNA和传统危险因素被全部包含在自变量中，并将吸烟、性别、年龄、饮酒、糖尿病史和高血压史全部包含在内；在模型3中，传统危险因素、miRNA和血脂水平被包含于自变量中，包括甘油三醋和总胆固醇。

2.2 miRNA作为分子生物标志物的可行性

综合使用ROC曲线后，深入剖析let-7e-5p表达水平作为分子生物标志物的具体情况，最终得出的结论为具有较强的可行性。在模型Ⅰ里面，ROC曲线状态下，外周全血let-7e-5p表达水平的面积与传统危险因素（总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇等高）的面积基本相同。纳入miRNA后，外周全血let-7e-5p表达水平的面积却出现了大幅度增加，与传统危险因素进行比较后，差异明显，具有较强的统计学意义。见表2。

3讨论

早期诊断和治疗对于降低卒中引起的死亡率以及改善预后具有重要意义。目前缺血性脑卒中诊断主要依赖影像学检查和临床表現，尚缺乏有效可靠的血液生物标记物，增加了对缺血性脑卒中开展早期筛查的难度[8]。因此，积极寻找有效的血液生物标记物有着极其重要的临床价值。

本研究结果显示，观察组患者表现出的相关信息直接影响着缺血性脑卒中患者与外周血let-7e-5p表达水平之间的关联性，且二者之间的关联性非常强。在传统危险因素的基础之上，将let-7e-5p引入其中，会使疾病的诊断与预测准确性得到明显的提高，为后期将外周血let-7e-5p表达水平作为核心生物标记物奠定了坚实的基础[9]。相关研究显示[10～11]，let-7e-5p在Ⅱ型糖尿病大鼠心肌微血管内皮细胞里出现了上升情况，与血管生成功能紊乱之间存在着千丝万缕的联系。在心血管疾病发病机制中，let-7e-5p起到了至关重要的作用。血液粘度升高、内膜损伤和脑动脉粥样硬化等都会导致脑动脉血栓出现，血小板聚集性发生根本的改变以后，血液流动性就会发生不同程度的变化，血小板质量和内皮损伤起到了重要的作用。在脑卒中患者急性发病时，血小板会快速消耗，导致血小板数量快速下降，刺激骨髓巨核细胞增生和血小板形成，血小板快速生长后，其体积和分布宽度都会发生不同程度的变化。在该研究中，研究对象的相关指标要比对照组高很多，剩余指标变化不突出。通过对血小板参数信息进行综合分析发现，脑卒中患者的病情变化与血小板有着直接的关系，能够对患者病情变化做出客观分析[12]。

综上，缺血性脑卒中发病风险与let-7e-5p表达水平之间存在着明显的关联。

参考文献

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