白细胞介素-33通过激活p38 MAPK信号调节儿童急性髓系白血病细胞中IL-4的表达

王一倩 朱泽钰 侯寒漪 罗焕敏 虞红娇

摘要：目的：探究急性髓系白血病（AML）细胞如何通过白细胞介素-33（IL-33）影响骨髓（BM）微环境，从而促进其生存的机制。方法：通过酶联免疫吸附测定或细胞计数微珠阵列试剂盒测量IL-33、IL-4的表达水平。通过免疫印迹定量磷酸化的p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、p38和GAPDH的表达。使用流式细胞仪通过凋亡评估细胞存活信号。通过实时定量荧光PCR测量IL-4、Actb mRNA的表达;结果：在诊断出的AML患者中，血清IL-33水平与IL-4水平相关;从体外实验中检测到，IL-33诱导的BM和外周血（PB）样品中IL-4水平升高;IL-33以p38 MAPK依赖的方式增加了白血病细胞中IL-4的表达。结论：为IL-33信号传导在AML发生过程中的关键作用提供了证据。

关键词：急性髓系白血病;白细胞介素-33;白细胞介素-4;P38丝裂原活化蛋白激酶通路

急性髓细胞性白血病（Acute Myeloid Leukemia，AML）是一种遗传异质性克隆恶性肿瘤，其特征是反复发生染色体重排，最终导致骨髓祖细胞在骨髓（Bone Marrow， BM）和外周血（Peripheral Blood， PB）中积累[1]。尽管近年来儿童AML的治疗有所进步，不到65%的患者在初次诱导缓解治疗后的3年内仍能够存活[2]。但开发新的替代方法对更有效地治疗AML仍至关重要。肿瘤微环境能够通过保护癌细胞免受抗癌药和环境压力的影响[3～4]。白血病细胞和BM微环境之间的相互作用关系一直是探究AML发展机制的研究热点。

IL-33是一种来自IL-1家族的细胞因子，可调节宿主防御，免疫调节和炎症反应[5]。在表达慢性髓样白血病（CML）的BCR-ABL中，IL-33信号传导可通过促进耐药性促进细胞存活，并且促进细胞因子的分泌[15]。表达融合基因Cbfb-MYH11 的原代小鼠AML细胞高度表达IL-33的受体，即白介素1受体样1（interleukin-1 receptor like 1， IL1RL1）。随后发现，向AML患者白血病细胞中加入IL-33能够有效抑制凋亡，激活P38丝裂原活化蛋白激酶通路（p38 MAPK），并增加IL-4和IL-6 mRNA水平[6～8]。本实验以儿童AML白血病细胞为模型，探讨AML患者细胞中IL-4的表达水平是否受IL-33的调节。

1材料与方法

1.1 材料

选取2020年4～12月在广州市妇女儿童医疗中心（伦理编号：2020-39500）确诊的AML患者。采集初诊儿童AML患者或者健康供者（HD）的血清样本（1～2 ml），BM（2～3 ml）和PB（2～3 ml）来自新诊断的儿童AML患者和HD。采用人单个核细胞分离液分离出单个核细胞 （Mononuclear Cell， MNC）。

1.2 細胞培养

白血病细胞培养液为RPMI-1640和含体积分数为10%的FBS，于37℃、体积分数为5% CO2的培养箱中培养，在倒置显微镜下观察细胞生长状况。

1.3 酶联免疫吸附测定

根据产品说明书分别测定AML初诊患者和HD对照组的血清IL-33的水平。将样品与辣根过氧化物酶（HRP）缀合的抗体一起温育，然后添加HRP底物TMB导致显色。在过氧化物酶的催化作用下，TMB变成蓝色，并使用酶标仪在450 nm下测量每个孔的吸光度，确定样品的特定浓度。

1.4 流式细胞仪珠阵列

将50 μl上清液与50 μl捕获珠在室温下孵育1 h，然后将混合物与50 μl藻红蛋白（Phycoerythrin，PE）检测试剂在室温下孵育2 h。然后将混合物用1 ml BD CBA洗涤缓冲液洗涤1次，以200 g沉淀5 min，重悬于300 μl洗涤缓冲液中。最后通过Beckman Coulter流式仪获取数据，使用FCAP Array Software 3.0进行分析。

1.5 Western Blot蛋白免疫印迹

将细胞沉淀重悬于已加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中，并在冰上孵育20 min，随后在4℃以13000 rpm离心30 min，并收集上清液。采用 BCA 法测定蛋白浓度，调节浓度至同一含量。采用SDS-PAGE进行凝胶电泳，再转移到PVDF膜上，5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，然后TBST洗2次。过夜孵育一抗（1：1000），Washing buffer洗3次后，室温孵育1 h二抗（1∶5000），Washing buffer洗3次后，采用ECL显影。

1.6 实时荧光定量PCR

将细胞用冰冷的PBS洗2次后，加入总NA提取试剂，室温裂解10 min，然后加入等体积的氯仿，剧烈振荡30 s后，室温静置15 min，然后以12 000 r /min离心10 min，吸取上清液转移到新的离心管中。加入500 μl 冷的异丙醇溶液，上下振荡1 min后室温静置10 min。高速12 000 r /min离心10 min，白色沉淀即为总RNA。采用cDNA合成试剂盒获取反转录产物，得到的cDNA产物采用SYBR荧光定量PCR试剂盒扩增检测基因的相对表达水平，引物序列为： IL-4（正向引物： 5'- CACAACTGAGAAGGAAACCTTCTG-3'，反向引物5'-CTCTCTCATGATCGTCTTTAGCCTTTC-3'）; Actb（正向引物： 5'-GGATGCAGAAGGAGATCACTG -3'，反向引物： 5'- CGATCCACACGGAGTACTTG-3'）[9～10]。

1.7 统计学分析

研究中的数据采用（±s）表示，数据采用Graphpad Prim 8软件进行作图和统计分析。两组间比较采用Student' s t -test，三组以上数据采用one-way ANOVA，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果与分析

2.1 初诊AML患者的血清IL-4浓度与IL-33浓度呈负相关

使用表达Cbfb-MYH11融合基因的敲入小鼠的AML细胞，与未处理的AML细胞相比，IL-33处理可提高IL-4 mRNA表达水平，表明IL-33 / IL1RL1通路可能通过诱导IL -4的表达来调节白血病细胞活性。为了进一步检查AML中IL-33和IL-4之间的关系，测量了来自新诊断的AML患者IL-33、IL-4的血清浓度。结果表明，血清IL-4水平与基线水平的IL-33水平呈负相关（r = -0.640，P = 0.046）（见图1）。为了进一步评估IL-4水平与患者预后之间的关系，将来收集患者的临床随访研究非常重要。

2.2 IL-33调控原代AML细胞中IL-4的产生

IL-33可以刺激人肥大细胞中Th1，Th2细胞因子和趋化因子的产生，从而促进炎症反应[11]。为了确定IL-33是否调节AML患者样本中的IL-4表达，用IL-33或与IL-33阻断抗体联合处理原代BM和PB MNC细胞，并在72 h后检查IL-4的mRNA表达。结果发现，与未处理的细胞相比，IL-33的加入显著诱导了IL-4 mRNA地表达。IL-33阻断抗体的加入消除了BM和PB样品中IL-33引起的IL-4基因转录的增加（见图2A-B）。为了确定IL-33是否介导IL-4的分泌，测量了上述处理后上清液中IL-4的水平。根据CBA结果，与未处理的细胞相比，IL-33显着增加了BM和PB细胞中IL-4的分泌，而IL-33阻断抗体的加入则显著降低了由IL-33诱导的IL-4的水平（见图2C）。这些结果表明，AML细胞分泌的IL-4受IL-33调节，揭示了由IL-33 / IL1RL1途径调节的抗凋亡机制。

2.3 在临床AML样本中IL-33通过p38 MAPK促进IL-4表达

既往工作表明，IL-33通过激活p38 MAPK通路及抑制AML的凋亡，同时诱导的IL-6表达和分泌。本实验中，将使用p38 MAPK途径的特异性抑制剂SB203580（SB）来检查p38 MAPK是否磷酸化调节AML临床样本中IL-4的产生。将特定浓度的外源IL-33单独或联合SB加入培养中的AML患者的BM和PB细胞中。72 h后发现，与对照组相比，IL-33的治疗诱导了p38 MAPK的磷酸化，加入SB后p38 MAPK的磷酸化显着降低（见图3A-B）。通过进行CBA检测上述处理组上清液中的IL-4水平发现，与未经处理的细胞相比，经IL-33处理的细胞中IL-4水平显著升高，而在BM和PB细胞中，与单独使用IL-33处理相比，SB处理显著降低了IL-4分泌水平。此外，通过进行qRT-PCR发现，SB处理可减轻BM样品中由IL-33处理引起的IL-4 mRNA表达增加（见图3C）。结果表明，p38 MAPK信号传导是AML临床样本中IL-33诱导的IL-4水平的重要途径。

3讨论

AML约占儿童白血病的20%，总生存率约为65～70%。尽管在过去十年中出现了新的治疗方法，但AML仍与不良预后密切相关。因此，开发针对AML的新替代疗法非常重要。在AML中，在于骨髓中各种类型的细胞因子对帮助AML细胞存活和耐药性起着非常重要的作用，包括IL-10、IL-1β、TNF-α [12～14]。 作为IL-1细胞因子家族的新成员，IL-33已被证明能通过白介素受体相关激酶M（IRAK-M）磷酸化作用以及结合激活脯氨酰顺反异构酶（PIN1）促进树突状细胞（DC）活化[15]。相关研究表明，AML患者的血清中IL-33水平相对于正常人显著升高。IL-33同时促进原代小鼠AML细胞中IL-4 mRNA的表达。为进一步探讨IL-33介导的AML生存率的机制，探究血清中IL-4和IL-33水平之间的关系以及外源性IL-33治疗是否调节AML患者BM及PB樣本IL-4表达。

研究发现新诊断的AML患者血清IL-33水平与IL-4水平降低有关。由于获取患者样品的数量有限，只能推测IL-4的基线浓度与患者血清IL-33呈中等程度的负相关。因此，分析大量患者样本以证实我们的假设十分必要。通过进行CBA，结果显示IL-33导致原代AML细胞IL-4基因表达以及分泌显著增加。重要的是，p38 MAPK抑制剂可部分消除IL-33诱导的IL-4水平的升高。这些数据表明IL-33通过激活p38 MAPK途径诱导IL-4表达。IL-4被证明可以通过激活STAT6和磷酸化NF-κB来抑制慢性淋巴细胞性白血病（CLL）细胞凋亡。

综上所述，本研究提供了IL-33可能通过调节IL-4表达来调节白血病细胞存活的证据。更重要的是，p38 MAPK可能确实在AML中通过IL-33 / IL1RL1轴调节IL-4表达和分泌中起关键作用。

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