miR-424-5p靶向KIF23调控细胞周期并抑制肝癌细胞的增殖和迁移能力

丁梦羽,肖葛琼

(绍兴文理学院附属医院 肿瘤内科,浙江 绍兴 312000)

肝癌是世界范围内癌症相关死亡的第4大常见原因,也是发病率和死亡率逐年上升的少数肿瘤之一[1]。常规化疗和放射治疗对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的疗效有限[2],HCC患者的五年生存率小于5%[3]。近年来,微小RNA(miRNA)已被验证在多种恶性肿瘤的发生和发展中起显著作用。Piao等[4]发现过表达miR-424-5p可以抑制肝癌细胞增殖,并诱发细胞凋亡。KIF23属于KIF家族,在多个肿瘤组织和细胞中高度表达[5]。已有研究[6]发现,正常肝组织中未检测到KIF23的拼接变异(KIF23 V1和KIF23 V2),却在HCC组织中呈异常表达。KIF23的表达与肝癌的发生发展有关,但KIF23对肝癌的调控机制还不明确。本研究探究miR-424-5p和KIF23在肝癌中的调控机制,以探索新的肝癌靶向治疗途径。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 正常人肝细胞系HL-7702[L-02](BNCC100012)、人肝癌细胞系HCCLM3(BNCC351888)、MHCC97-L(BNCC337741)均购买于北纳生物。37 ℃、5% CO2的条件下,HL-7702[L-02]细胞培养于含10% FBS的RPMI-1640培养基中,HCCLM3和MHCC97-L细胞培养于含10% FBS的DMEM高糖培养基中。

1.2 细胞转染 miR-424-5p mimics(miR-mimics)、miR-NC、miR-424-5p inhibitor(miR-inhibitor)、inhibitor-NC以及pcDNA3.1-KIF23质粒(oe-KIF23)和空的pcDNA3.1质粒(oe-NC)均购自Ribobio(中国)。按照Lipofectamine 2000试剂盒(Invitrogen,美国)说明书将miR-424-5p mimics、NC-mimics和质粒转染到肝癌细胞系HCCLM3中,转染24 h。

1.3 实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR) 使用TRIzol试剂(Thermo Fisher Scientific,美国)按照制造商使用说明书从细胞中提取总RNA,并使用iScript cDNA synthesis Kit(Bio-Rad,美国)将miRNA和mRNA反转录为cDNA。使用SYBR-Green方法(Qiagen,德国)在Bio-Rad CFX96定量实时PCR系统上检测miR-424-5p和KIF23的相对表达,分别用U6和GAPDH作为内部参照。用2-ΔΔCt方法分析miR-424-5p和KIF23的表达。具体引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 细胞增殖实验 将细胞悬液以每孔约2×103个细胞转移到装有100 μL含10% FBS的DMEM培养基的96孔板中,分别在0 h、24 h、48 h、72 h、96 h将10 μL CCK-8溶液(碧云天,中国)添加到每个孔中。在37 ℃下孵育1.5 h后,使用Spectra Max 250分光光度计(Molecular Devices,美国)测量450 nm的吸光度。

1.5 流式细胞术实验 调整细胞浓度为100个/mL离心收集细胞沉淀加入预冷75%乙醇于4 ℃固定后,用100 μL的RNase A(100 μg/mL,Sigma-Aldrich,美国)处理细胞。再加入500 μL碘化丙啶(PI染液,50 μg/mL,Sigma-Aldrich, 美国)后4 ℃避光孵育30 min。用流式细胞仪(Beckman-Coulter,美国)分析细胞周期分布,结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。测定各组G0/G1期、S期、G2/M期细胞百分比,并进行比较。

1.6 克隆形成实验 将肝癌细胞(2×103个/孔)接种于6孔板培养板中,在FBS的完全培养基中培养;当细胞形成肉眼可见的克隆(每个克隆细胞数在50～150个左右)时终止培养,用4%多聚甲醛固定细胞并用0.1%的结晶紫染色。使用配备有MicroPublisher 3.3 RTV相机的光学显微镜捕获图像,计算每孔的克隆数。

1.7 划痕愈合实验 使用划痕愈合实验检测细胞的迁移能力。将细胞接种在6孔板中,当细胞覆盖达到80%时使用200 μL移液管尖端轻轻刮擦穿过孔中心的单层,然后用PBS洗细胞2次以去除划下的细胞,加入无血清培养基。放入37 ℃培养箱中培养,于0 h和24 h时拍照记录。

1.8 双萤光素酶实验 使用位点突变法构建野生型(wt)KIF23-WT和突变型(mut)KIF23-MUT 3’-UTR的pmirGLO载体(Promega,美国)。使用Lipofectamine 2000试剂盒(Invitrogen,美国)将100 nM miR-mimics/miR-NC和KIF23-WT/KIF23-MUT质粒共转染到肝癌细胞系HCCLM3中。转染后48 h,通过双萤光素酶报告基因检测试剂盒(Promega,美国)检测萤光素酶活性。

1.9 蛋白质免疫印迹(western blot,WB) 使用BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific,美国)测量蛋白质浓度并定量,10% SDS-PAGE上电泳分离蛋白并转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF,Millipore,美国),室温下用5%脱脂牛奶封闭1 h后在4 ℃下与一抗孵育过夜。将膜与二抗在室温下孵育1 h。使用增强型化学发光检测系统(Thermo Fisher Scientific,美国)对蛋白质进行可视化。一抗为兔抗KIF23(Abcam,英国)、GAPDH(Abcam,英国),二抗为山羊抗兔IgG(Abcam,英国)。

1.10 生物信息分析 从TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)获得肝癌组织中差异表达的miR-424-5p,并在TCGA肝癌的mRNA差异分析中筛选出2 244个在肿瘤组织中上调的mRNA,同时利用TargetScan、miRTarBase、mirDIP数据库对miR-424-5p进行靶基因预测,并与上调的2 244个DEmRNA取交集获得与miR-424-5p相关性最大的基因KIF23。TCGA-LIHC数据集分析KIF23在正常组织和癌组织中的表达水平。利用Targetscan数据库预测miR-424-5p和KIF23的结合位点(http://www.targetscan.org/mamm_31/)。

1.11 统计分析 应用SPSS 25.0软件和GraphPad Prism 8.0进行统计分析,组间数据差异比较采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-424-5p在肝癌中的表达情况 基于TCGA数据分析显示,与正常组织比较,miR-424-5p在肝癌组织中显著低表达(P<0.05)。qRT-PCR检测结果显示,miR-424-5p在肝癌细胞系(HCCLM3、MHCC97-L)中的表达量(0.30±0.04、0.46±0.03)均低于正常人肝细胞系(HL-7702),差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 过表达miR-424-5p对HCCLM3细胞生物功能的影响 转染miR-424-5p-mimics/miR-NC至HCCLM3细胞系中,细胞的miR-424-5p表达量显著上调(P<0.05),见封三图1A,可用于之后的实验。CCK8和克隆形成实验结果显示,miR-424-5p过表达组的细胞增殖能力(1.09±0.08;26±3)低于NC组(1.42±0.09;54±4),差异有统计学意义(P<0.05),见封三图1B、C。划痕愈合实验结果表明,转染miR-424-5p-mimics的细胞迁移能力(16.70±1.33)低于miR-NC的细胞(29.40±2.16),差异有统计学意义(P<0.05),见封三图1D。流式细胞术分析细胞周期分布,发现转染miR-mimics后HCCLM3细胞阻滞在G0/G1期(封三图1E)。

2.3 敲低miR-424-5p对MHCC97-L细胞生物功能的影响 qRT-PCR检测结果显示,转染miR-inhibitor后的细胞miR-424-5p表达量(0.39±0.03)显著下调(P<0.05)。CCK8和克隆形成实验结果显示,与NC组(1.38±0.13,60±6.0)相比,敲低miR-424-5p(1.88±0.17,123±11)明显增强MHCC97-L细胞的增殖能力,差异有统计学意义(P<0.05)。划痕愈合实验结果显示,miR-inhibitor组的细胞迁移能力(37.0±4.0)高于inhibitor-NC组(26.0±3.0),差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术分析细胞周期分布,结果显示抑制miR-424-5p的表达使得MHCC97-L细胞周期阻滞于S期。

2.4 miR-424-5p与KIF23在肝癌细胞中的关系 分析结果显示,miR-424-5p和KIF23 3’-UTR具有结合位点(图1A),miR-424-5p与KIF23有靶向结合关系(图1B)。TCGA-LIHC数据集分析结果显示,KIF23在肝癌组织中的表达高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05),见图1C。qRT-PCR和WB 检测发现KIF23在肝癌细胞系中的表达量(HCCLM3:2.50±0.20,MHCC97-L:2.10±0.18)均高于正常人肝细胞系,差异有统计学意义(P<0.05),见图1D、E。与miR-NC和inhibitor-NC组(1.00±0.10)相比,miR-424-5p过表达组的KIF23表达显著下调(0.51±0.05);敲低miR-424-5p后,KIF23表达显著上调(1.98±0.18);差异均有统计学意义(P<0.05),见图1F、G。

A.生信预测miR-424-5p与KIF23的靶向结合位点;B.双萤光素酶实验检测不同处理组的荧光素酶活性;C.KIF23在正常组和肿瘤组的表达量箱线图;D.qRT-PCR检测在正常细胞系和肝癌细胞系中KIF23 mRNA 表达水平;E.Western blot 实验检测正常细胞和肝癌细胞系中KIF23蛋白水平;F.qRT-PCR检测不同转染组KIF23 mRNA的表达;G.Western blot检测不同转染组KIF23蛋白表达情况;* P<0.05。图1 KIF23与miR-424-5p在肝癌细胞中的关系Figure 1 The relationship of KIF23 and miR-424-5p in liver cancer cells

2.5 miR-424-5p与KIF23共同作用对肝癌细胞生物功能的影响 构建对照组(miR-NC+oe-NC)、KIF23过表达组(miR-NC+oe-KIF23)、miR-424-5p和KIF23共过表达组(miR-mimics+oe-KIF23),qRT-PCR和Western blot实验结果显示oe-KIF23组中KIF23表达显著上调(P<0.05),KIF23过表达组、共过表达组细胞中KIF23的表达量(3.10±0.30、1.12±0.10)与对照组相近(1.00±0.11),见图2A、B。CCK8和克隆形成实验结果显示,过表达KIF23显著增强肝癌细胞的增殖能力,进一步过表达miR-424-5p会抑制KIF23过表达对细胞增殖能力的促进作用(图2C、D)。划痕愈合实验发现,KIF23过表达组的细胞迁移能力(39.00±2.16)高于对照组(31.00±3.33)和共过表达组(33.00±2.57),差异均有统计学意义(P<0.05),见图2E。

A、B.不同转染组细胞中KIF23 mRNA和蛋白的表达;C、D.CCK8和克隆形成实验检测不同转染组细胞的增殖能力;E.划痕愈合实验检测不同转染组细胞的迁移能力;*P<0.05。图2 miR-424-5p与KIF23共同作用对肝癌细胞生物功能的影响Figure 2 The effect of miR-424-5p and KIF23 on the biological function of liver caner cells

2.6 miR-424-5p与KIF23共同作用对肝癌细胞周期的影响 流式细胞术分析显示, KIF23过表达组细胞周期阻滞于S期,共过表达组细胞周期阻滞于G0/G1期,见图3。

*P<0.05。图3 流式细胞术分析不同转染组的细胞周期分布情况Figure 3 The effect of miR-424-5p and KIF23 on the cell cycle of liver cancer cells

3 讨论

学者对miRNA在疾病中的发生和进展作用机制进行了广泛研究,发现miR-424-5p在多种癌症中发挥不同的调控作用:miR-424-5p作为抑制基因在结直肠癌[7]、甲状腺癌[8]等多种癌症中抑制肿瘤细胞增殖和迁移,同时也能作为促癌因子促进胃癌、胰腺癌等肿瘤的细胞增殖[9-10]。在本研究中,我们证实了miR-424-5p在肝癌细胞中低表达,且miR-424-5p能抑制肝癌细胞的增殖和迁移,使细胞周期进程阻滞于G0/G1期,说明miR-424-5p在肝癌细胞中是抑癌因子,发挥抑癌作用。

近年来,研究证实KIF23可作为肺癌[11]、胃癌[5]、卵巢癌[12]的潜在治疗靶点。在有丝分裂晚期,中心纺锤体蛋白是由两种成分组装而成的复合体,而KIF23是这两种必要成分之一,此复合体的形成被称为细胞因子学的重要步骤[13]。基于KIF23在细胞周期中的重要地位,研究靶向KIF23的调控因子有助于揭示抑制肿瘤细胞增殖的相关机制。有研究[12]揭示在卵巢癌细胞中miR-424-5p能直接靶向抑制KIF23的表达,从而抑制卵巢癌细胞增殖和迁移。此外,KIF23还作为胶质瘤患者的独立预后生物标志物。Sun等[14]研究发现,KIF23过度表达会促进脑胶质瘤的发展,减少KIF23的表达会抑制脑胶质瘤细胞的增殖。KIF23还被证实在晚期肺癌和原发性肺癌的极大部分转移性淋巴结中过度表达,因此抑制KIF23表达能够有效抑制肺癌细胞生长[11]。但KIF23在肝癌进展中的生物学功能研究较少,目前仅有Sun等[6]首次揭示了肝细胞癌中KIF23的表达及其表达与临床特征的相关性。在本研究中我们通过生信分析预测KIF23与miR-424-5p存在靶向关系,双萤光素酶实验进一步验证了miR-424-5p与KIF2的靶向结合关系。通过细胞生物学实验,我们发现KIF23在肝癌细胞中表达上调,并且过表达KIF23后,肝癌细胞的增殖和迁移能力增强,导致细胞周期阻滞在S期,当同时过表达miR-424-5p和KIF23后能削弱过KIF23对肝癌细胞增殖和迁移,细胞周期进阻滞在G0/G1期。因此,在肝癌细胞中miR-424-5p能够靶向下调KIF23的表达,抑制肝癌细胞的发生与发展。

综上所述,本研究证明了在肝癌中miR-424-5p靶向KIF23调控细胞周期,抑制肝癌细胞的增殖和迁移能力,这个结论可为探索肝癌靶向治疗途径提供新的方向。