MTHFR和MTRR 基因多态性及增补叶酸与早产的相关性分析

陈雪 刘小晖 王兴 周秉博 郝胜菊 郑雷

早产是一类复杂性疾病，目前研究热点仍然是鉴定新的易感基因和多态位点，从单个基因的易感性研究向基因通路或基因组的研究转变，通过探索“基因-环境”交互作用阐明早产发病机制，而叶酸摄入与叶酸代谢酶基因多态性交互作用可能是导致早产的其中一个通路[1]。流行病学资料调查发现，叶酸摄入不足和低血清叶酸浓度会导致早产。国外人群研究表明，育龄妇女孕前1年补充叶酸可预防50%以上的重度早产[2]。亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(methionine synthase reductase, MTRR)是叶酸代谢过程中的关键酶，参与同型半胱氨酸代谢。研究显示，MTHFRC677T和MTRR基因多态性在早产中可能是通过促进“叶酸——高同型半胱氨酸血症——甲基化”途径来产生作用[3]，但目前小样本量的流行病学研究MTHFR基因多态性和早产相关性的结果不一致[4-7]。

中国育龄妇女叶酸缺乏率较高，北方高于南方[8]。甘肃地处中国的西北，经济欠发达，蔬菜摄入量不足，育龄妇女叶酸摄入也不足。本研究采用病例-对照设计，研究孕产妇增补叶酸、易感基因MTHFR、MTRR多态性与早产的关系，初步探索基因环境交互作用与早产的关系，为开展预防工作、降低甘肃省早产发生率提供科学依据。

对象与方法

一、对象

本研究选取2017年5月—2018年8月在甘肃省妇幼保健院分娩早产儿的162例孕产妇作为病例组，按照1∶1比例选取同时期分娩正常孕周新生儿的孕产妇162例作为对照组，并采用问卷形式收集两组流行病学及临床资料。病例组纳入标准：年龄18～40岁、兰州市居住一年以上、妊娠满28周不足37周、自然发动宫缩或胎膜早破等引发早产患者，对于因妊娠高血压疾病、糖尿病、妊娠期胆汁淤积等合并症可能由于医疗干预导致早产的患者不纳入病例组。对照组纳入标准：足月分娩(巨大儿除外)孕妇、孕妇年龄相差不超过1岁、居住地类型(城市或农村)一致、末次月经相差不超过2周(避免因季节及空气质量对妊娠结局的影响)、无妊娠合并症。排除双胎和多胎、新生儿有先天性疾病患者。

二、方法

经知情同意后，分别采集两组新生儿母亲静脉血，提取全血中的 DNA，进行叶酸代谢相关基因检测。

1.MTHFR和MTRR基因的检测：采用荧光定量 PCR 反应对MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66G位点的单核苷酸多态性(single nucleotide polymor-phism，SNP)分型进行检测。相关仪器试剂均购自美国 Applied Biosystems(ABI)公司产品。反应所用Taqman-MGB 探针信息如表1所示。每个反应的体系为总体积10 uL，包含浓度为20 ng/uL的DNA模板1 uL、2×Taqman Universal Master Mix 5 uL、20×Taqman-MGB探针0.5 uL，去离子水3.5 uL。反应条件为95 ℃ 10 min，随后进行20个循环的扩增(92 ℃15 s，60 ℃ 1 min)，再进行 30 个循环的扩增(89 ℃15 s，60 ℃ 90 s)，之后 4℃保存。反应结束后在 ABI7900 型荧光定量 PCR 仪上读取样品孔中的终点荧光，利用其分析软件确定各样本的基因分型结果。对研究对象MTHFRA1298C、C677T和MTRRA66G位点进行测定。按照基因检测结果，可将个体对叶酸利用能力风险等级进行划分，分成高度风险、中度风险、低度风险及未发现风险共四个等级(见表2)。

表1 Taqman-MGB 探针所在位置Table 1 The location of Taqman-MGB Probe

表2 MTHFR和MTRR基因风险等级评估表Table 2 The risk rating scale for MTHFR and MTRR genes

2.统计学处理：本研究采用双录入方法，应用EpiData 3.1进行数据的录入，Excel 2010及SPSS 17.0进行数据处理和统计分析，各因素组间比较采用卡方检验，单因素分析有统计学意义的因素纳入多因素Logistic进行分析，α取0.05为检验水准。

结 果

一、研究对象一般特征

本研究按照对照组与病例组纳入标准，共纳入新生儿324例，病例组162例，男96例，女66例，对照组162例，男91例，女71例。样本MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66G位点的数据分别通过Hardy-Weinberg遗传平衡检验，P>0.05，均符合Hardy-Weinberg遗传平衡，证明研究样本具有该区域群体代表性。其中，孕妇年龄、受教育程度、孕前BMI指数、孕期体重增加、文化程度等因素经分析与早产无关。

二、早产相关因素的单因素分析

研究结果显示，与汉族孕妇相比，少数民族孕妇为早产的危险因素，OR=2.28，说明少数民族妇女出生早产儿的概率较汉族妇女高；与城镇妇女比较，农村妇女是早产的危险因素，OR=2.99；与非兰州市居住的妇女相比，兰州市居住的孕妇是早产的危险因素，OR=2.18；与初次怀孕相比，怀孕3次以上是早产的危险因素，OR=1.77；与没有妊高症的孕妇相比，有妊高症的妇女为早产的危险因素，OR=4.63；与自然怀孕的孕妇相比，采用辅助生殖技术受孕是早产的危险因素，OR=9.67；与没有服用叶酸的孕妇相比，服用叶酸的孕妇是早产的保护性因素，OR=0.14；与孕期前3个月服用叶酸相比，孕期服用叶酸3～6个月与6个月以上是早产的保护性因素，OR值分别为0.12、0.25；与孕期没有药物服用史的孕妇相比，有药物服用史的孕妇为早产的危险因素，OR=1.96。见表3。

表3 早产的单因素分析结果Table 3 Risk factors of preterm birth

续表3

三、早产相关因素的多因素Logistic回归分析

以是否生育早产儿为因变量，以单因素分析有统计学意义的10个因素为自变量，包括民族、户籍、居住地、孕次、是否有妊高症、是否辅助生殖技术、有无服用叶酸、孕前3个月服用叶酸、孕期服用叶酸3～6个月与6个月以上、孕期药物服用史，应用多因素logistic回归进行分析。多因素logistic回归结果显示，农村户籍、兰州本地居住、妊高症、采用辅助生殖技术受孕4个因素为早产的危险因素；孕前3个月、孕期3～6个月和孕期6个月以上服用叶酸是早产的保护性因素。结果见表4。

表4 早产危险因素的多因素Logistic回归结果Table 4 Multivariate logistic regression on risk factors of preterm birth

四、MTHFR 和MTRR基因多态性与孕期服用叶酸情况对早产的影响

根据基因风险等级评估，分为未发现风险、低度风险、中度风险、高度风险4组，应用卡方检验对不同风险组是否服用叶酸与早产的关系进行分析，结果显示，在早产组中，各风险组是否服用叶酸差异具有统计学意义(P<0.05)；在未发现风险组中，孕妇是否服用叶酸对早产结局无统计学意义(P<0.05)；在低风险组中，孕妇是否服用叶酸对早产结局无统计学意义(P>0.05)；在中度风险组中，孕妇是否服用叶酸对早产结局具有统计学意义(P<0.05)；在高风险组中，孕妇是否服用叶酸对早产结局也有统计学意义(P<0.05)。

表5 基因多态性与孕期服用叶酸情况对早产的影响 [例(%)]Table 5 Effects of gene polymorphism and folic acid supplementation during pregnancy on preterm delivery [n(%)]

讨 论

一、早产相关影响因素分析

1.MTHFR和MTRR基因的影响：分子流行病学和遗传学研究已经对叶酸代谢通路中关键酶基因多态和出生缺陷的易感性进行了大量报道，其中MTHFRC677T和A1298C位点成为研究的热点[9]。这两个位点也被用来研究与早产易感性的关系，但是结论不一致。MTHFR和MTRR基因缺陷导致的叶酸利用能力下降成为寻找早产易感遗传因素的热点[10]。相关研究显示[11]，TT基因型与叶酸代谢功能障碍有关，导致血浆中同型半胱氨酸含量增高，继而导致机体生化功能的异常，从而导致胎儿早产。也有研究提示MTHFR基因与MTRR基因多态性与叶酸代谢相关，导致机体同型半胱氨酸浓度的增加[12]。本研究在单因素分析中，尚不能认为MTHFR基因和MTRR基因的多态性与早产有直接的关系，关于此方面的研究尚需进一步研究探讨，MTHFR基因和MTRR基因的多态性可能因不同环境因素交互作用而导致早产的发生。

2.孕期服用叶酸对早产的影响：本研究针对叶酸服用的时间进行分层分析，研究发现，孕前服用叶酸，与孕前1个月开始相比，孕前3个月服用叶酸是早产的保护性因素，差异具有统计学意义，孕前6个月开始服用叶酸，差异无统计学意义。孕前3个月服用叶酸可以显著较低早产的风险，提倡备孕妇女孕前3个月开始服用叶酸。本次研究还发现孕期服用叶酸也是早产的保护性因素，与孕期3个月相比，孕期服用叶酸至3～6个月是早产的保护因素；与服用叶酸3个月相比，孕期服用叶酸至6个月以上也是早产的保护性因素，说明孕期服用叶酸至6个月以上可以显著降低早产发生风险。胎儿神经管畸形的发生是在怀孕的前28 d内，而此时大多数孕妇还未意识到已经怀孕，所以面临着叶酸缺乏的风险，并会影响到胎儿[13]。因此预防神经管缺陷，叶酸补充的最佳时间应该从准备怀孕前3个月至整个孕早期，这样可使胎儿患神经管畸形的风险减少50%～70%[14]。在孕中、后期，宝宝DNA的合成，胎盘、母体组织和红细胞增加都使孕妇对叶酸的需要量大大增加，所以即使宝宝的神经系统在孕早期已经发育完成，但孕中、后期叶酸的缺乏仍然会引起巨幼红细胞性贫血、先兆子痫、胎盘早剥的发生风险。

3.MTHFR和MTRR基因多态性与孕期因素交互作用对早产的影响：根据相关研究[14]，MTHFR和MTRR基因是叶酸代谢过程的关键基因，其多态性可能导致叶酸代谢的异常，引起不同的疾病，如高同型半胱氨酸血症，但目前关于基因多态性与环境交互作用对早产的研究较少。本研究发现，基因型的不同可以对妊娠结局产生不同的影响。基因型风险等级评估越高的人群，可能存在叶酸代谢障碍，而通过服用叶酸，一定程度上弥补了叶酸缺乏的需求，可能会避免早产的发生风险。孕前服用叶酸在不用基因风险等级中差异不同，研究发现在早产组中，各风险组是否服用叶酸差异具有统计学意义；在中度风险组及高风险组中，孕妇是否服用叶酸对早产结局也有统计学意义。说明随着基因型的不同，对服用叶酸的时间差异具有显著性。说明对高风险组人群的叶酸服用，按照个体差异，需要服用叶酸从孕前3个月至孕期6个月以上。本次研究为初次探讨不同基因型孕前服用叶酸的影响，在未发现风险组中，孕期服用叶酸的时间长短，对早产的结局也不同，在高风险组，也得出一致的结果，而低度风险组与中度风险组，差异无统计学意义。本研究通过叶酸代谢相关基因多态性与叶酸服用之间交互作用的研究发现，对于孕妇孕期服用叶酸，可以根据孕妇基因型的不同进行个体化服用指导，这对孕妇临床服用叶酸具有重要指导意义。

本研究通过探讨早产的相关因素，明确了服用叶酸、孕前3个月服用叶酸、孕期3～6个月服用叶酸与孕期6个月以上服用叶酸为相关保护性因素，孕前、孕期服用叶酸应根据不同基因型选择个体化服用，如基因风险等级越高，叶酸服用时间应延长至孕前3个月、孕期6个月以上。本研究的局限性包括未涉及叶酸服用剂量，样本量偏少，尚需进一步探讨研究。