山楂叶原花青素对肿瘤坏死因子-α诱导人脐静脉内皮细胞细胞间黏附分子-1 和 E-选择素过表达的影响

李澎，王建农，许勇刚，付建华，刘建勋

中国中医科学院西苑医院，北京 100091

山楂叶原花青素对肿瘤坏死因子-α诱导人脐静脉内皮细胞细胞间黏附分子-1 和 E-选择素过表达的影响

李澎，王建农，许勇刚，付建华，刘建勋

中国中医科学院西苑医院，北京 100091

目的 观察山楂叶原花青素对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的人脐静脉内皮细胞细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和 E-选择素过表达的影响，探讨其抗炎作用的机制。方法 体外培养人脐静脉内皮细胞。MTT法检测细胞活力，流式细胞术检测 ICAM-1 和 E-选择素的表达。结果 山楂叶原花青素浓度≤200 mg/L 时，对细胞活力无明显影响；模型组人脐静脉内皮细胞 ICAM-1 和 E-选择素表达较正常组显著升高，10、20、30、40、50 mg/L 山楂叶原花青素浓度依赖地抑制 ICAM-1 和 E-选择素的表达升高，其中 40、50 mg/L 组较模型组差异有统计学意义。结论 山楂叶原花青素能够抑制 TNF-α 诱导的血管内皮细胞 ICAM-1 和 E-选择素的过表达，这可能与其抗炎作用相关。

山楂叶；原花青素；血管内皮细胞；肿瘤坏死因子-α；细胞间黏附分子-1；E-选择素

过度的炎症反应是动脉粥样硬化、缺血性心脏病、中风、感染性休克等疾病发展、恶化乃至造成死亡的关键病理环节。因此，抑制炎症发生、阻断炎症反应过程，对于这些重大难治疾病的治疗具有重要意义。山楂叶具有活血化瘀、降脂消浊的功效。原花青素是山楂叶的重要活性成分，约占山楂叶黄酮类物质总量的 20%。有研究显示，原花青素可抑制炎症细胞的激活、降低炎症因子的释放，还可以直接对抗氧自由基、氮过氧化物等炎症毒素对细胞的杀伤[1-2]。我们前期研究显示，富含原花青素的山楂叶提取物能抑制缺氧复氧诱导的白细胞与内皮细胞的黏附，降低白细胞黏附分子的表达[3]。但是，山楂叶原花青素对炎性反应中血管内皮细胞黏附分子表达的影响尚缺乏研究。本实验以肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激人脐静脉内皮细胞，观察山楂叶原花青素对内皮细胞2种经典黏附分子，即细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和E-选择素过表达的影响，探讨其抗炎作用的机制。

1 实验材料

1.1 脐带

剖腹产健康婴儿无菌脐带，购自北京市海淀区妇幼保健院。

1.2 药物及制备

山楂叶原花青素，本院实验中心参照文献[4]方法制备。6 倍体积 60%乙醇加热山楂叶 1 h，过滤，取滤液，回收至无醇味。经AB8树脂吸附，水洗至清。70%乙醇洗脱树脂至无色，收集洗出液，回收至无醇味。加氯仿萃取 2次，去除叶绿素，聚酰胺吸附，烘干。

1.3 试剂

原花青素标准品（纯度＞95%，沃玛特公司，4852-22-6），Ⅰ型胶原酶（Gibco 公司，17100-017），胰酶（Amesco 公司，0458），内皮细胞培养基（M 200-500）及其添加物（S003-10），Cascade 公司。重组人 TNF-α（CytoLab 公司，300-01A），藻红蛋白（PE）标记小鼠单克隆抗人 ICAM-1 荧光抗体（BD公司，347977），异硫氰酸荧光素（FITC）标记小鼠单克隆抗人 E-选择素荧光抗体（R&D 公司，BBA21），PE 标记小鼠 IgG2a（BD 公司，349053），FITC 标记小鼠 IgG1（R&D 公司，IC002F）。

1.4 仪器

Synergy 4 多功能酶标仪，Biotek 公司；Navios 流式细胞检测仪，Beckman Coulter公司。

2 实验方法

2.1 山楂叶原花青素纯度测定

采用香草醛法，参照文献[5]方法进行。

2.2 人脐静脉内皮细胞的培养与鉴定

将内皮细胞培养添加物按1∶50的比例加入内皮细胞培养基，并加入青霉素和链霉素（终浓度分别为100 U/L 和 100 μg/L），配制成完全内皮细胞培养基。取婴儿脐带，长约 20 cm。PBS 洗净血迹，从脐静脉上端插入剪去针尖的 12号针头，以止血钳固定。通过针头向脐静脉内注入 PBS，冲洗 3 遍，洗净残血。以另一止血钳夹闭脐静脉下端，向脐静脉内注入以DMEM 培养基配制的 0.1%Ⅰ型胶原酶，取出针头，夹闭脐静脉上端。37 ℃消化 15 m in。收集脐静脉内的消化液，PBS 冲洗 2～3 遍，将流出液体与消化液合并，1500 r/m in 离心 10 m in，取沉淀。加入完全内皮细胞培养基，每条脐带所得细胞约加 5 m L。将细胞吹打均匀，加入培养瓶内，37 ℃、5%CO2培养。当细胞生长至 80%融合时，进行传代。PBS 冲洗 3 遍，0.25%胰酶 37 ℃消化 5 m in，收集细胞，1∶3 传代。实验使用第 3代细胞。免疫荧光检测血小板Ⅷ因子表达。

2.3 人脐静脉内皮细胞活力检测

细胞完全融合生长后，弃去培养基，PBS 洗 3遍。加入含有药物的完全内皮细胞培养基，继续培养。药物以 DMSO 溶解，按 1∶1000 比例加入培养基内。正常组给予含 0.1 m L/L DMSO 的培养基。24 h 后弃去培养基，PBS 洗 3 遍，培养板内加入 1 g/L PBS 配制的 MTT 溶液，继续培养 4 h；弃去 MTT 液，培养板内加入 DMSO，室温放置 15 m in，于波长 490 nm处测定吸光度（OD）。

2.4 造模和给药

待细胞长满培养皿后，弃去培养基，PBS 冲洗 3遍。加入含有药物的完全内皮细胞培养基，继续培养1 h。药物以 DMSO 溶解，按 1∶1000 比例加入培养基内。正常组和模型组给予含 1 m L/L DMSO 的培养基。之后，模型组和给药组按 1∶1000 比例向培养基内加入 PBS 配制的重组人 TNF-α（终浓度 10 μg/L），正常组给予等量 PBS。继续培养 4 h。

2.5 细胞间黏附分子-1 和 E-选择素检测

弃去培养基，PBS 洗 3 遍，0.01%胰酶-0.02%EDTA消化 10 min。胎牛血清终止消化，收集细胞，PBS 洗3 次。4 ℃、1500 r/m in 离心 10 min，弃去上清液，加入 10 μL PBS，吹打均匀，平均分作 2 份。一份加入 5 μL 抗 ICAM-1 抗体和 5 μL 抗 E-选择素抗体，另一份加入 5 μL PE 标记小鼠 IgG2a 和 10 μL FITC 标记小鼠 IgG1，作为同型对照。4 ℃、避光孵育 30 min。4 ℃、1500 r/min 离心 10 m in，弃去上清液，PBS 洗1 次。收集细胞，每份细胞加入 25 μL 多聚甲醛固定15 min，加入 250 μL PBS，4 ℃避光保存，24 h 内测定。流式细胞术测定 PE 和 FITC 荧光强度，以同型对照调定检测范围。各样本荧光强度＝测定管荧光强度－同型对照管荧光强度。每次实验每组只作1个样本，以对模型的表达抑制率（1－给药组样本荧光强度÷同次实验模型样本荧光强度）衡量药效。

3 统计学方法

采用 SPSS16.0 统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较用方差分析或 Kolmogorov-Smirnov Test检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 山楂叶原花青素的纯度测定

0.006 25～0.1 g/L 浓度范围内，标准品浓度与 OD 值呈良好的线性相关。回归方程为原花青素浓度（g/L）＝3.306 3×OD 值－0.140 6，r2＝0.998 3；山楂叶原花青素样品的测定点分布在标准品曲线的附近，表明其纯度与标准品相近或稍高。见图1。

图 1 山楂叶原花青素与原花青素标准品纯度比较

4.2 人脐静脉内皮细胞的培养与鉴定结果

培养的内皮细胞成梭形、卵圆形或多角形，融合生长时呈青石子铺路状，见图 2。抗血小板Ⅷ因子免疫荧光染色均为阳性，阳性表达部位在胞浆，呈绿色；细胞核以 DAPI染色呈蓝色，见图 3。

4.3 山楂叶原花青素对人脐静脉内皮细胞活力的影响

与正常组比较，山楂叶原花青素 25、50、100、200 mg/L 组人脐静脉内皮细胞活力无明显差异，见表 1。

表 1 各组人脐静脉内皮细胞活力比较（±s）

表 1 各组人脐静脉内皮细胞活力比较（±s）

组别 浓度/（mg/L） n OD 值正常组 5 0.101±0.004山楂叶原花青素组 200 5 0.102±0.003 100 5 0.102±0.005 50 5 0.106±0.003 25 5 0.100±0.004

4.4 山楂叶原花青素对肿瘤坏死因子-α诱导的人脐静脉内皮细胞细胞间黏附分子-1 和 E-选择素过表达的影响

与正常组比较，模型组 ICAM-1、E-选择素荧光强度明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，山楂叶原花青素各浓度均可抑制 ICAM-1、E-选择素的表达升高，其中 40、50 mg/L 原花青素差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），见图 4、表 2。

图 4 ICAM-1 和 E-选择素流式细胞检测直方图

图 2 培养 3 代的人脐静脉内皮细胞（×100）

图 3 培养 3 代的人脐静脉内皮细胞鉴定（免疫荧光染色，×200）

表 2 各组人脐静脉内皮细胞 ICAM-1 和 E-选择素过表达比较（±s）

表 2 各组人脐静脉内皮细胞 ICAM-1 和 E-选择素过表达比较（±s）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 浓度/（mg/L） n ICAM-1 E-选择素荧光强度 抑制率 荧光强度 抑制率组 4 0.33±0.17 0.68±0.32组 4 11.25±1.05** 5.03±2.00**叶原花青素组 10 4 0.18±0.10 -0.01±0.18 20 4 0.18±0.25 0.02±0.15 30 4 0.20±0.17 0.08±0.16 40 4 0.38±0.09## 0.25±0.10#50 4 0.35±0.14## 0.32±0.14##

5 讨论

炎症是一种极其重要的病理过程。它是有血管生物体对损伤因素做出的一种非特异性的反应，其主要表现为实质器官细胞的变性和死亡、血液成分和血细胞的渗出及炎性、组织间质细胞的增生。一方面，炎症反应有助于清除感染病原体以及损伤、死亡的细胞，对机体具有有利的影响；但是，过于强烈的炎症反应会波及那些原本正常的组织，使其出现严重的水肿、缺血缺氧和代谢障碍，并大量杀伤那些原本未出现损伤的细胞，从而导致严重的附加伤害[6]。

白细胞等炎症细胞黏附于血管内皮是炎症反应中最为关键的一环，它是炎症诱发一系列严重损伤的必要前提。白细胞黏附会阻塞微血管，阻碍乃至终断血流供应，还会影响血液回流，造成组织水肿；黏附的白细胞渗入组织深处，释放氧自由基、毒性细胞因子、水解酶等，直接导致细胞的变性与死亡及组织基质的崩解。白细胞黏附于血管内皮细胞依赖于它们各自表面的黏附分子，这些黏附分子通过受体配基样作用相互结合，介导白细胞的黏附。

ICAM-1 和 E-选择素是血管内皮细胞表达 2 个最重要的黏附分子。前者属于免疫球蛋白超家族，通过与白细胞上整合素分子（包括 CD11、CD18 等）相作用，使白细胞与血管内皮细胞产生牢固的结合。而后者属于选择素家族，与白细胞的 E-选择素配基相作用，介导黏附的早期过程，如白细胞与内皮细胞的接触及白细胞在内皮细胞上的滚动等。它们的表达主要受到炎性细胞因子的调控，TNF-α、白细胞介素-1 等均具有很强的诱生作用。

山楂叶的主要活性成分是黄酮和原花青素。黄酮含量较高，约占提取物总量的 80%，余下部分为原花青素。WS®1442 为德国开发的一种山楂叶制剂，在当今临床上得到广泛的应用。对其抗心肌缺血作用的研究表明，山楂叶提取物的药理作用主要依赖于原花青素而非含量更高的黄酮，增加提取物中原花青素的含量可以显著改进疗效[7]。

本研究结果显示，在 10～50 mg/L 浓度范围内，山楂叶原花青素能剂量依赖地抑制 TNF-α 诱导的人脐静脉内皮细胞 ICAM-1 和 E-选择素的过表达，且抑制作用对药物浓度有一定的依赖性，并在 40、50 mg/L达到高峰。这一药物有效浓度范围与量效关系，与我们对山楂叶原花青素抗心肌细胞缺氧损伤的研究结果是一致的，这也提示 40～50 mg/L 可能就是山楂叶原花青素干预不同疾病的共同最佳范围[8]。结合山楂叶原花青素对人脐静脉内皮细胞的毒性实验结果，浓度高至 200 mg/L 的山楂叶原花青素也未显示出明显的细胞毒性，其有效作用的浓度范围是安全的。

至于山楂叶原花青素是如何抑制炎症介质诱导的血管内皮细胞 ICAM-1 过表达的，我们推测可能与其抗氧化的性质有关。有研究表明，包括上调 ICAM-1在内的绝大多数 TNF-α 的生物学效应，均是氧自由基依赖的[9]。其具体机制还需进一步实验验证。

综上所述，本研究结果提示，山楂叶原花青素能抑制炎症反应中血管内皮细胞 ICAM-1 的表达上调，这可能是其抗炎机制之一。

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Effects of Haw thorn Leaf Procyanidins on Over Exp ressions of ICAM-1 and E-selectin in Hum an Umbilical Vein Endothelial Cells Induced by TNF-α

LI Peng, WANG Jian-nong,XU Yong-gang, FU Jian-hua, LIU Jian-xun (Xiyuan Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100091, China)

Objective To observe the effects of haw thorn leaf procyanidins (HLP) on over expressions of ICAM-1 and E-selectin in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) induced by TNF-α，and clarify the mechanism of HLP’s anti-inflammation effect. Methods HUVEC were cultured in vitro. MTT assay was used to detect cell viabilities. The expressions of ICAM-1 and E-selectin in HUVEC were detected by flow cytometry. Results Up to 200 mg/L, HLP showed no significant decrease in cell viabilities; the expression levels of ICAM-1 and E-selectin in the model group significantly increased, compared With that in the normal group; 10, 20, 30, 40, 50 mg/L HLP inhibited the expression elevations of ICAM-1 and E-selectin in concentration-dependent manner; and there were statistical significances in 40, 50 mg/L HLP groups, compared With the model group. Conclusion HLP can inhibit the over expressions of ICAM-1 and E-selectin of vascular endothelial cells induced by TNF-α, which possibly underlies HLP’s anti-inflammation effect.

haw thorn leaf; procyanidins; vascular endothelial cell; TNF-α; ICAM-1; E-selectin

R285.5

A

1005-5304(2017)08-0050-04

2016-11-29）

（

2016-12-13；编辑：华强）

国家自然科学基金（81274196）；北京市自然科学基金（7092089）

付建华，E-mai l：j ianhuaf fcn@263.net

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.012