RhaFGF局部外敷促进糖尿病大鼠难愈性皮肤溃疡修复的研究

宋久于 王敏华 李海坤 廖宝春 陈小波 朱贤森 曾祥泰▲

1.赣南医学院第二附属医院皮肤科，江西赣州 341000；2.赣南医学院第一附属医院普外科，江西赣州 341000；3.赣南医学院第二附属医院康复科，江西赣州 341000；4.赣南医学院病理教研室，江西赣州 341000

糖尿病皮肤溃疡是糖尿病患者截肢的主要原因，该病致残率和致死率高，且治疗愈合后容易复发。糖尿病皮肤溃疡是因糖尿病引起的内环境改变（如高血糖、糖尿病性血管病变和神经病变）和由糖尿病引起的皮肤局部病理变化（如伤口感染、愈伤组织形成和创伤性应激）共同作用产生的严重并发症。约有70%的2 型糖尿病患者将会发生外周神经病变[1]，使下肢和足底肌肉群萎缩无力，足弓力学失衡致跖骨压力明显增高，最终导致糖尿病足难愈性溃疡的发生[2-3]。糖尿病溃疡患者的皮肤经常摩擦衣物或鞋子等，加剧感染，导致异常疼痛[4-5]，给患者带来巨大的痛苦。因此，有必要依据其发病机制，探索更安全、更有效的治疗方法。

成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors，FGF）是人体活性蛋白的一种微量元素，分为酸性成纤维细胞生长因子（acidic fibroblast growth factor，aFGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），可调控一系列复杂的病理生理过程[6]。aFGF可诱导不同细胞的分化和增殖，诱导缺血区域的血管形成[7]，并增强肉芽组织的形成[8]，目前已成为创面修复领域的热点。在糖尿病难愈性溃疡初期，巨噬细胞和受损部分的内皮细胞释放aFGF，刺激成纤维细胞和角质形成细胞的增殖，从而诱导产生蛋白酶、胶原酶和各种细胞因子[9]。有学者对深Ⅱ度烧伤糖尿病大鼠模型进行HE 染色，结果显示aFGF 组细胞增殖明显高于糖尿病组[10]。目前利用基因工程技术研发的一类新药重组人酸性成纤维细胞生长因子（recombinant human acidic fibroblast growth factor，RhaFGF）已经在临床上用于糖尿病溃疡治疗，其临床效果正在被越来越多的临床数据所证实[11]。本研究旨在通过生化分析、组织病理学及免疫荧光的方法，探究RhaFGF 对糖尿病大鼠难愈性皮肤溃疡愈合的影响，并进一步研究其修复作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

于2020年2月至4月选取30 只健康雄性2月龄SPF 级SD 大鼠（湖南斯莱克景达实验动物有限公司），体重180～200 g。本研究经赣南医学院第二附属医院伦理委员会审核批准。

1.2 药品与试剂

链脲霉素（streptozotocin，STZ）购自北京索莱宝科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；Ki-67 抗体，CD31 抗体和HRP 标记山羊抗小鼠抗体购自北京生物科技有限公司；RhaFGF（商品名：艾夫吉夫）购自上海腾瑞制药有限公司。

1.3 糖尿病大鼠溃疡模型的制备

取30 只大鼠高脂高糖饲料（1.5%胆固醇、0.25%胆酸钠、10%猪油、5%蔗糖、83.25%基础饲料）喂养4周后，禁食过夜（不禁水）12 h 后在其腹腔注射STZ（35 mg/kg），5 d 后血糖≥11.1 mmol/L 为造模成功[12]。存活糖尿病大鼠用10%水合氯醛麻醉后，背部剃毛进行常规消毒，在其背部用龙胆紫标记两等大圆形区域，总面积约为3.14 cm2。以外科手术剪小心沿标记处剪去全层皮肤，深至筋膜。8 h 后大鼠背部创面无感染、红肿，大鼠活动能力、生命体征正常为造模成功[12]。造模成功后的糖尿病溃疡模型在SPF 级动物环境饲养（其中2 只大鼠造模未成功）。

1.4 大鼠分组与给药

造模成功的28 只糖尿病溃疡大鼠编号后根据随机数字表法分为RhaFGF 组和对照组，每组14 只。两组大鼠的体重、溃疡面积比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。RhaFGF 组给予RhaFGF 100 U/cm2局部外敷治疗，对照组给予0.9%氯化钠溶液0.1 ml/cm2局部外敷治疗。

1.5 评估伤口愈合指标及方法

分别于给药治疗后的第7、14 天进行拍照（拍照使用5 cm 焦距1 倍视野）及收集皮肤溃疡样本，使用Image-J 软件处理拍照图片计算创面溃疡面积，运用SOD、MDA 试剂盒在酶标记法检测SOD、MDA 的绝对含量，HE 染色病理学观察，免疫荧光检测CD31 及Ki-67 表达的组织细胞阳性颗粒数并采用HPIAS-100 分析系统计算其阳性表达率。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，符合正态分布且方差齐的计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用率表示，两组间比较采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组溃疡创面面积的比较

治疗前，两组的溃疡创面面积比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗第7、14 天，两组的溃疡创面面积均小于治疗前，RhaFGF 组的溃疡创面面积小于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗第14 天，两组的溃疡创面面积均小于治疗第7 天，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 两组溃疡创面面积的比较（cm2，±s）

表1 两组溃疡创面面积的比较（cm2，±s）

对照组RhaFGF 组t 值P 值14 14 3.138±0.142 3.127±0.098 1.053＞0.05 1.590±0.099 1.204±0.021 5.437＜0.05 0.792±0.035 0.509±0.012 5.039＜0.05 7.063 7.963＜0.01＜0.01 8.459 8.834＜0.01＜0.01 6.495 6.073＜0.01＜0.01组别 例数 治疗前 治疗第7 天 治疗第14 天 t 治疗前与治疗第7 天比较值P 治疗前与治疗第7 天比较值t 治疗前与治疗第14 天比较值P 治疗前与治疗第14 天比较值t 治疗第7 天与治疗第14 天比较值P 治疗第7 天与治疗第14 天比较值

2.2 两组SOD 活性和MDA 含量的比较

治疗第7、14 天，RhaFGF 组的MDA 含量低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；RhaFGF 组的SOD活性高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗第14 天，RhaFGF 组的MDA 含量低于本组治疗第7天，SOD 活性高于本组治疗第7 天，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组的MDA 含量、SOD 活性高于本组治疗第7 天，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2～3）。

表2 两组大鼠MDA 含量的比较（nmol/mg，±s）

表2 两组大鼠MDA 含量的比较（nmol/mg，±s）

对照组RhaFGF 组t 值P 值14 14 0.50±0.05 0.38±0.04 4.517＜0.05 0.65±0.17 0.19±0.04 5.314＜0.05 3.623 5.764＜0.05＜0.05组别 例数 治疗第7 天 治疗第14 天 t 值 P 值

表3 两组大鼠SOD 活性的比较（U/mg，±s）

表3 两组大鼠SOD 活性的比较（U/mg，±s）

对照组RhaFGF 组t 值P 值14 14 0.08±0.09 0.19±0.01 4.843＜0.05 0.18±0.08 0.32±0.09 5.364＜0.05 3.342 5.343＜0.05＜0.05组别 例数 治疗第7 天 治疗第14 天 t 值 P 值

2.3 两组CD31、Ki-67 阳性表达率的比较

治疗第7、14 天，RhaFGF 组的CD31、Ki-67 阳性表达率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；治疗第14 天，两组的CD31、Ki-67 阳性表达率高于本组治疗第7 天，差异有统计学意义（P＜0.05）（表4～5）。

表4 两组大鼠CD31 阳性表达率的比较（%，±s）

表4 两组大鼠CD31 阳性表达率的比较（%，±s）

对照组RhaFGF 组t 值P 值14 14 7.33±2.17 20.13±3.78 7.306＜0.01 13.70±2.54 29.54±6.35 6.551＜0.01 6.327 7.154＜0.01＜0.01组别 例数 治疗第7 天 治疗第14 天 t 值 P 值

表5 两组大鼠Ki-67 阳性表达率的比较（%，±s）

表5 两组大鼠Ki-67 阳性表达率的比较（%，±s）

对照组RhaFGF 组t 值P 值14 14 6.27±1.53 20.79±10.79 6.768＜0.01 10.73±2.54 36.95±8.25 7.591＜0.01 5.327 7.954＜0.05＜0.01组别 例数 治疗第7 天 治疗第14 天 t 值 P 值

2.4 组织病理学检查结果

分别在第7、14 天取两组大鼠溃疡组织进行HE染色，每个观察时间点取4 张切片，在每张切片中随机选取4 个高倍视野；40 倍镜下完成计数。结果见图1（封四），第7 天对照组大鼠有大量的炎症细胞浸润，只有少量的成纤维细胞和新生的毛细血管，而RhaFGF 组新生的毛细血管、成纤维细胞数量和胶原蛋白表达量明显增加。第14 天RhaFGF 组发现有大量的毛细血管、成纤维细胞和胶原蛋白在溃疡边缘形成，再上皮化水平及成纤维细胞数量明显高于对照组。

3 讨论

糖尿病皮肤溃疡的修复是一个复杂的生物学过程，包含创面氧化应激炎症反应、肉芽组织增生和再上皮化等方面，受多种细胞因子参与及调控。FGF 是一种能促使细胞增殖的蛋白质因子家族，具有促进细胞增殖和分裂的功能，调控血管生成、创伤修复等过程[13]。MDA 是脂质过氧化的最终产物；SOD 是一种生物活性物质，可以消除代谢产物。本研究结果显示，使用RhaFGF 可以减少皮肤溃疡处的MDA 含量，提高SOD 的活性，有效减轻糖尿病皮肤溃疡的氧化应激带来的损伤程度，提示RhaFGF 可促进糖尿病大鼠难愈性皮肤溃疡的修复。

新生毛细血管可改善伤口微循环，为组织修复提供氧气和营养，促进溃疡创面的愈合[14]。成纤维细胞是伤口修复的主要细胞，在溃疡形成后合成和分泌足够的胶原蛋白和细胞外基质成分，参与肉芽组织增生、创面愈合和组织再生过程[15]。HE 染色结果显示，RhaFGF 组与糖尿病组比较，新生的毛细血管、成纤维细胞的含量以及胶原蛋白的表达量显著增加，提示RhaFGF 通过诱导血管分化、增加新生毛细血管的数量改善溃疡创面微循环，为其提供氧气和营养物质，促进溃疡创面修复。

RhaFGF 通过增强CD31 和Ki-67 增殖蛋白的表达，可以促进成纤维细胞的增殖。CD31 是一种表达于造血细胞和内皮细胞表面的130-kD 的糖蛋白，是一种细胞黏附分子[16]，CD31 分子的密集程度可以反映新生血管的密集程度，表达量与细胞增殖密切相关[17]。Ki-67 是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与细胞有丝分裂密切相关。导致糖尿病足溃疡创面难愈的主要原因在于创面肉芽组织中细胞成分增殖不足和过度氧化应激[18-19]。本研究结果显示，RhaFGF 可促进CD31 和Ki-67 的释放，增强成纤维细胞增殖和胶原蛋白表达。

综上所述，RhaFGF 通过促进糖尿病难愈性溃疡的氧化应激、增加溃疡组织的毛细血管和成纤维细胞生成提高上皮再生水平，从而促进大鼠糖尿病溃疡组织的修复。