肿瘤抑素19肽对SK-Hep-1细胞增殖和凋亡作用的影响

王 顺 刘桃源 李 昂 衣同辉 潘洪明 李淑艳

齐齐哈尔医学院医学技术学院，黑龙江齐齐哈尔 161006

肝癌是一种恶性肿瘤，在全球恶性肿瘤发病中排名第六位，5年生存率仅为18%[1]，肝细胞癌占原发性肝癌4/5[2]。肝细胞癌起病隐匿，临床症状不明显，多数患者确诊已属于中晚期[3]。传统的手术、放疗和化疗等的治疗效果均不理想，同时传统的化疗药物副作用大，易出现多药耐药性，因此，探索高效低毒的抗肿瘤新药是医药研究的首要任务。生物活性肽广泛存在于自然界的生命体中，包括细菌、植物、无脊椎动物及脊椎动物中[4]。生物活性肽具有抗菌、抗癌和免疫调节等功能[5]，分子量相对较大的生物活性肽提纯及合成难度大，副作用也大。因此，研发分子量小、具有高特异性、高效性、低毒性的抗癌生物活性肽成为近年来生物医学领域研究的热点[6-7]。肿瘤抑素是胶原蛋白Ⅳα3链非胶原区域的生物活性多肽片段[8]，肿瘤抑素靠近C 端的第185～203 位氨基酸之间的区域称为肿瘤抑素19 肽。研究发现[9]，19 肽能抑制新生血管形成，诱导黑色素瘤等细胞凋亡，对低分化SGC-7901胃癌细胞、HepG2 肝癌细胞也有抑制增殖作用[10-11]。但19 肽对肝癌SK-Hep-1 细胞的增殖、凋亡及转移能力的影响还未见报道。本课题研究19 肽对SK-Hep-1细胞增殖能力和凋亡作用的影响，探讨19 肽对SKHep-1 细胞转移能力的影响，为肝癌的生物治疗提供临床应用的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

肝癌细胞株SK-Hep-1 购自中科院细胞库，胎牛血清购自Biosharp 公司；肿瘤抑素19 肽购自安徽国肽生物科技有限公司；DMEM-H 培养基购自Gibco公司；CCK-8 试剂盒购自南京碧云天生物技术公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI 试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司；DAPI 荧光染料购自北京索莱宝生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 19 肽对SK-Hep-1 细胞增殖能力的影响 SKHep-1用含10%胎牛血清的DMEM-H 培养基在37℃，5%的CO2培养箱中常规培养。待细胞融合度90%以上时，用0.25%胰酶消化，计数，调整细胞密度为1×104个/ml，每孔100 μl 接种于96 孔板中培养。向各孔中加入19 肽（浓度分别为0、50、100、150、200、250 μg/ml，每个浓度设3 个复孔）。分别培养24、48 h后，在450 nm 波长测吸光度值。通过计算半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50），筛选出19 肽最佳作用浓度。

1.2.2 DAPI 染色观察SK-Hep-1 细胞凋亡的形态学变化 19 肽处理细胞同“1.2.1 项”。细胞按1×106个/孔，接种于6 孔板，待细胞贴壁后培养24 h，用PBS 洗1次，每孔加4%多聚甲醛溶液，置-20℃固定20 min，PBS洗2 次，加DAPI 染液室内避光染色10 min，PBS洗2次，镜下340 nm 波长激发荧光，荧光显微镜下观察各组细胞形态变化。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 细胞处理同“1.2.1项”，按1×106个/孔/3 ml，接种于6 孔板，待细胞贴壁后培养24 h，用PBS 洗2 次，加入100 μl 膜联蛋白结合缓冲液重悬细胞，加入5 μl AnnexinⅤ-FITC 和5 μl PIstaining solution，混均室温避光孵育10 min，染色完成后，加入400 μl 膜联蛋白结合缓冲液，混匀，用流式细胞仪在488 nm 激发波长、530 nm 发射波长下检测。

1.3 统计学方法

采用统计学软件Graphpad 8.0 进行数据分析，定量资料采用均数±标准差（±s），组间比较采用t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 19 肽对肝癌SK-Hep-1 细胞增殖活性的抑制作用

0、50、100、150、200、250 μg/ml 浓度的19 肽作用SK-Hep-1 细胞24 h 后细胞存活率分别为（100.00±1.80）%、（95.64±1.92）%、（82.18±1.67）%、（68.43±1.39）%、（46.74±1.35）%、（42.49±1.85）%。作用48 h 后细胞存活率分别为（100.00±1.80）%、（87.27±1.96）%、（66.32±1.74）%、（58.78±1.94）%、（40.40±1.44）%、（22.15±1.51）%。细胞增殖活性明显受到抑制。19肽作用24 h 的IC50为200.00 μg/ml（图1）。

图1 19 肽对SK-Hep-1 细胞增殖活性的抑制作用

2.2 DAPI 染色观察SK-Hep-1 细胞凋亡的形态学变化

如图2 所示（封三），19 肽为0 μg/ml 时，SK-Hep-1细胞大部分染色均匀，呈蓝色，细胞未发生凋亡。与0 μg/ml 相比，50、100、150、200、250 μg/ml 浓度 的19肽作用24 h 后，部分细胞呈亮蓝色，细胞核出现浓缩、破裂、碎块状致密浓染或帽点状凋亡形态，随着药物浓度增加，细胞凋亡比率增高。

2.3 19 肽对肝癌SK-Hep-1 细胞凋亡率的影响

0、100、150、200、250 μg/ml 的19 肽作用SK-Hep-1细胞24 h 后，凋亡率分别为（13.15±0.42）%、（13.87±0.64）%、（17.15±0.68）%、（26.84±0.40）%、（32.24±0.41）%。细胞凋亡率随着19 肽浓度的增高而增加（图3）。

图3 19 肽对Sk-hep-1 细胞凋亡率的影响

3 讨论

肝癌是一种恶性肿瘤，在我国发病率和致死率相当[12]，其治疗方法以手术、放疗、靶向及小分子化学药物为主，手术后复发率和转移率高，放疗和化疗又存在特异性和敏感性差等问题[13]。而生物活性肽具有多种生理功能，如抗氧化、抗增殖和免疫功能等作用[14]，生物活性肽的这些活性具有抗癌潜力，有利于癌症治疗研究。肿瘤抑素是一种生物活性肽，具有抑制肿瘤新生血管生成、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用，但存在分子量大，相对副作用也大，以及存在难以提取或者合成等问题[15]。肿瘤抑素19 肽是通过肽的固相合成技术对肿瘤抑素进行改造修饰的小分子多肽，能够显著抑制肿瘤细胞的增殖。本研究探讨19 肽对SK-Hep-1 细胞的抑制作用及机制，结果显示CCK-8 实验中，在24 h 的SK-Hep-1 细胞增殖活性检测中，发现19 肽浓度为0～100 μg/ml 时，细胞存活率下降趋势较为平缓；19 肽浓度处于100～250 μg/ml 时，细胞存活率下降较陡直，提示随着19肽浓度的增加，肝癌SK-Hep-1 细胞的存活率逐渐降低。表明0～100 μg/ml 为平缓期，细胞对19 肽耐受；浓度在150～250 μg/ml 时，19 肽抑制SK-Hep-1细胞的增殖能力逐渐增强。另外，贺岩[10]动态观察到19 肽对胃癌细胞的增殖有抑制作用，表明19 肽具有抑制消化道肿瘤细胞增殖的作用。

凋亡在维持细胞稳态中至关重要，抗肝癌药物根除癌细胞主要通过诱导细胞的凋亡来实现[16]。本研究DAPI 染色检测可见，19 肽作用后SK-Hep-1 细胞的细胞膜变圆，细胞核大小不一，出现核内部染色质聚集、断裂，形成半月状或帽点状。通过流式细胞术进一步研究19 肽对肝癌SK-Hep-1 细胞凋亡的影响，结果表明，随着19 肽浓度的增加，早期凋亡和晚期凋亡细胞的概率均增加。19 肽浓度在0～100 μg/ml 时，细胞的凋亡率变化相对较小（12.73%～14.51%）；19 肽浓度处于150～250 μg/ml 时，细胞的凋亡率变化幅度较大（14.51%～32.65%）。推测SK-Hep-1 细胞可能对低浓度的19 肽（0～100 μg/ml）具有耐受性，超过此范围，稍微增加剂量就可以显著增加细胞的凋亡率。

衣同辉等[11]发现，肿瘤抑素19 肽能协同人参皂苷Rg3 诱导肝癌HepG2 细胞的凋亡。两者联合时，减少了人参皂苷Rg3 的用药剂量，同时增加了疗效。可见19 肽联合药物治疗肿瘤能减少化疗药物剂量，对疗效具有正相协同作用。

综上所述，19 肽能够抑制肝癌SK-Hep-1 细胞的增殖，促进其凋亡，今后将进一步探讨19 肽对SKHep-1 细胞转移能力的影响及机制，以及19 肽与化疗药物联合治疗肿瘤的效果及机制。为临床肿瘤的生物治疗提供理论指导。