肝脏缺血再灌注立早基因表达的研究进展

邓小雨 马莉

[摘要]肝脏缺血再灌注损伤是临床肝胆外科手术常见重要的并发症。其缺血及再灌注过程均可引起立早基因早期反应蛋白-1、c-Jun、c-Fos表达上调，急性期调控肝组织细胞炎症反应，导致严重的肝功能异常和器官功能障碍;恢复期调控肝组织再生重建;还作用于肝脏能量代谢，对患者的生存预后产生重要影响。立早基因是一类受到刺激后可以被快速而短暂地诱导的基因，且其激活不需要任何新蛋白的合成，目前为止，已在细胞中发现100多种立早基因。深入了解肝脏缺血再灌注立早基因表达及其调控过程可为改善肝缺血再灌注损伤及损伤后肝恢复提供新方向。本文对肝脏缺血再灌注立早基因表达的研究进展进行综述。

[关键词]肝缺血再灌注;早期反应蛋白-1;c-Fos;c-Jun

[Abstract] Hepatic ischemia reperfusion injury is a common and important complications in clinical hepatobiliary surgery. During the process of ischemia and reperfusion early response protein-1， c-Jun， c-Fos of immediate early genes expression was up-regulated， regulating hepatic tissue inflammatory response， resulting in serious hepatic function abnormalities and organ dysfunction. Those immediate early genes also regulate hepatic tissue regeneration and reconstruction in convalescent stage， playing an important role in hepatic energy metabolism， which has an important impact on the survival and prognosis of patients. Immediate early genes are a kind of genes which can be induced quickly and briefly after stimulation， and their activation do not require synthesis of any new proteins. So far， more than 100 kinds of immediate early genes have been found in cells. In-depth understanding of the expression and regulation of immediate early genes in hepatic ischemia-reperfusion may provide a new direction for ameliorating hepatic ischemia reperfusion injury and hepatic recovery after injury. This paper reviews the research progress of early gene expression of liver ischemia-reperfusion.

[Key words] Hepatic ischemia reperfusion; Early growth response-1; c-Fos; c-Jun

缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）損伤是一种随着血及氧流量的重新建立而加重缺血或缺氧器官细胞损伤的现象[1]。肝脏IR损伤是世界范围内肝脏疾病的首要关注问题，与失血性休克、肝切除和肝移植等有关[2]。许多研究表明，肝脏IR损伤与立早基因（immediate early genes，IEGs）的表达存在关联[1，3-4]。IEGs是一类含有亮氨酸拉链，在受到多种化学和物理的细胞外刺激（包括IR损伤）时表达的基因，IEGs编码转录因子，作为早期细胞质事件的核偶联器，调节损伤后细胞反应基因的表达，是基因-蛋白质相互作用的第一步[3]。IEGs不仅在机体受到刺激时即时表达，还对损伤后恢复、生长反应、癌症形成等起着重要作用[3]。肝脏IR过程IEGs早期反应蛋白-1（early growth response-1，Egr-1）、c-Jun、c-Fos的表达增加，急性期调控下游基因表达，引发级联瀑布反应，导致肝脏炎症损伤;恢复期诱导肝脏再生重建。除此之外，IEGs还可调节肝能量代谢。本文就IEGs对肝脏IR损伤调节的研究进展进行综述。

1 Egr-1基因对肝脏IR的调节作用

Egr-1也被称为NGFI-A、Krox-24、Zif268、TIS8和ZENK，是一种含锌指结构的IEGs[5]。Egr-1基因于1980年发现在血清刺激的静止期小鼠成纤维细胞中，其对多种刺激表达：细胞分裂素、发育和分化的过程、组织或辐射损伤、神经元信号，是机体对缺血应激反应的“主调节因子”[5-6]。大鼠肝IR模型中，缺血和再灌注早期肝组织Egr-1mRNA及Egr-1蛋白的表达均明显增加;Egr-1蛋白与DNA结合活性升高[7]。在小尺寸大鼠肝移植模型中再灌注后的前24 h内可发现Egr-1基因早期、过度表达[4]。

1.1 肝脏IR过程Egr-1基因的表达机制

肝脏受到IR损伤时，Egr-1基因在多种刺激下迅速而瞬时地表达，其能被多种细胞外激动剂[如低氧、生长因子、炎症因子、活性氧化物、钙离子、脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）等]和环境应激（如缺氧、流体剪切应力和血管损伤等）激活[3，8]。过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）在血管平滑肌细胞中会上调Egr-1的表达，促进损伤后血管重建[8]。在大多数巨噬细胞中，LPS作为机体的一种内毒素，其刺激Egr-1上调是完全激活TNF-α表达的必要条件[9]。

小尺寸肝移植模型由于肝血流量相对较大，流入小移植物会受到与血流动力学相关的额外损伤。肝移植术后门脉高压引起的血流动力学力变化导致剪应力改变对Egr-1的上调促进内皮素-1（endothelin-1，ET-1）和誘导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等细胞因子的上调，ET-1可直接引起肝窦收缩，破坏腺泡血流动力学;同时ET-1也能有效诱导Egr-1的表达[4]。这表明Egr-1和ET-1的相互作用可能使Egr-1表达呈现短时间内正反馈调节。而iNOS诱导一氧化氮（nitric oxide，NO）的表达，NO作为一种血管舒张因子，有助于改善微循环，同时NO可通过抑制细胞外信号调节激酶信号传导途径负反馈下调剪应力诱导的Egr-1表达，所以NO/ET-1比值平衡是决定肝脏IR损伤的重要因素[4，10]。

1.2 Egr-1基因在肝脏IR急性期的作用

肝脏IR急性损伤包括组织缺血性损伤和淤血性损伤、胆汁淤积性损伤，以及恢复血供后自由基损伤。IR急性期Egr-1基因上调，其主要作用是急性炎症期诱导大量炎症因子的生成，对机体造成炎症损伤;其次还对调节免疫反应、凝血、血管通透性、血管重建、伤口愈合反应等起着重要作用[11-12];同时还可能与肝脏能量代谢相关[13]。

Egr-1能诱导一系列与细胞损伤和修复再生相关的基因产物，包括炎症因子[肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1（interleukin-1，IL-1）]，黏附因子[细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）]，生长因子，受体及蛋白酶等[11，14]。Wang等[15]的研究表明，Egr-1还参与肝糖原合成，调节肝脏糖代谢。Egr-1过表达可抑制胰岛素信号通路，促进肝脏葡萄糖生成[13]。所以Egr-1可作为一种分子制动器，调节波动血糖水平，维持机体内稳态。而且Egr-1可能在胆汁淤积性炎症中起核心作用，是抑制胆汁淤积所致炎症的潜在治疗靶点[14]。

1.3 Egr-1基因对肝脏IR恢复期肝组织细胞增殖的调节作用

肝实质损伤或部分肝切除术后肝再生的能力是基于肝细胞从静止转变为增殖状态并重新进入细胞周期的能力[5]。据推测，部分肝切除后短时间内激活IEGs是实现肝细胞向有丝分裂的进一步进展的启动机制，IEGs表达模式可能代表移植肝的状态及其对移植肝损伤的长期反应，再生反应的程度与组织丢失量成正比，并受到复杂的相互作用信号机制的精确调控[16]。

有研究表明，缺乏Egr-1基因的小鼠表现为延迟肝切除后肝细胞有丝分裂进展;在肝细胞G0～G1进展后的肝再生过程中，Egr-1基因和Egr-1蛋白在再生肝中的表达明显增加，与有丝分裂进程重叠;并通过纺锤体组装检查点以调节肝细胞有丝分裂进程[16-17]。Egr-1可通过直接或间接诱导细胞分裂周期基因20（cell division cycle 20，CDC 20）的表达，而CDC 20是有丝分裂后期促分裂复合物的关键调节因子[17]。因此，Egr-1基因对肝IR过程肝组织细胞增殖有着不可替代的作用。

2 c-Fos、c-Jun基因对肝脏IR的调节作用

c-Fos、c-Jun是较早发现的两种原癌基因，属于IEGs，表达c-Fos、c-Jun蛋白。c-Jun、c-Fos蛋白的稳定性受磷酸化调控，c-Jun的转录活性由c-Jun N-末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）磷酸化诱导，一旦c-Jun被磷酸化，就能二聚体化并结合到广泛基因启动子元件上的识别位点，调节各种细胞效应的产生[18]。

正常情况下c-Fos mRNA仅少量表达，许多研究表明，c-Fos和c-Jun在肝、肾、脑、心、小肠IR早期激活，是IR损伤、再生增殖、凋亡的关键基因[19-21]。在大鼠、猪肝IR模型中再灌注早期c-Jun和c-Fos mRNA表达均增加，c-Jun和c-Fos的表达水平与缺血时间直接相关，在肝IR损伤刺激反应中起着重要的调节作用[22-23]。小鼠肝IR过程可分为急性期（1～3 h）和亚急性期（6～20 h），c-Jun和c-Fos的表达有两种不同的表达模式：c-Jun和c-Fos mRNA在急性灌注期损伤肝组织中共表达，随后c-Fos表达下降，在亚急性灌注期c-Jun持续高水平表达[23]。

2.1肝脏IR过程c-Fos、c-Jun基因的表达机制

c-Fos、c-Jun基因表达由大量的细胞外刺激（包括氧化剂和细胞因子）诱导。在肝脏IR损伤中c-Fos、c-Jun被LPS、炎症因子（TNF-α，IL-1β）、活性氧化物（NO，H2O2等）、生长因子、细胞质Ca2+超载等激活[24-25]。肝再灌注时，细胞外Ca2+透过细胞膜进入细胞内，导致细胞质Ca2+超载，胞内Ca2+超载可增加c-Fos调控元件上游的敏感转录因子结合位点启动IEGs的表达，胞内钙信号还可通过促进肝细胞周期进展来促进大鼠肝切除模型术后肝再生[25]。

2.2 c-Fos、c-Jun基因在肝脏IR急性期的作用

c-Fos、c-Jun基因可调控相应基因表达，不仅对炎症及抗炎基因表达，还对肝脏能量代谢，促癌、抗癌过程，胆固醇、胆汁酸的表达，肝纤维化的发生等的调节起着重要作用[26-28]。在肝脏IR急性期，c-Fos、c-Jun基因可促进中心粒细胞相关炎症因子的表达[27]。c-Fos、c-Jun基因可促进细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、iNOS等的表达;c-Jun mRNA在体内可被诱导募集到TNF-α启动子中，这是LPS刺激TNF-α基因表达所必需的[27]。同时c-Jun的表达还可调节肝糖异生和机体体温变化[18]。

2.3 c-Fos、c-Jun基因对肝脏IR恢复期再生、重建、凋亡的影响

有许多研究表明，c-Fos、c-Jun能够诱导动物IR模型肝、肾、脑、心、小肠等器官的增殖或凋亡[19-21]。c-Jun和c-Fos表達时间、器官可能决定了这些分子是否促进了再生或凋亡过程，在神经细胞中，c-Jun和c-Fos的持续表达导致细胞死亡，而短暂的表达则与再生有关[20]，而大鼠肝脏、小肠的瞬时表达与再生凋亡均有关，细胞可通过阻断c-Fos蛋白而丧失对增殖信号的反应能力，缺乏c-jun基因的小鼠肝部分切除后肝细胞增殖减少，且肝生成受损[21]。

在大鼠门静脉分支结扎模型中，缺血肝萎缩及增殖部分早期反应中c-Fos、c-Jun的表达均有增加，表达差异并没有很明显。这可能提示细胞的增殖凋亡可能不仅仅由IEGs早期的表达决定，还在于中后期某些基因在应激反应后数小时内位于反馈检查点上，以调整细胞的走向是增殖还是凋亡[29];但这些早期反应IEGs的表达在恢复肝细胞对后期和更特异的细胞增殖信号的敏感性方面起着重要作用，这也提示增殖和凋亡都需要对细胞进行类似的初始修饰，或者至少使用一条最初的共同途径[29]。不同的c-Fos和c-Jun mRNA表达水平对细胞凋亡、增殖过程有双重调节作用，c-Fos/c-Jun异二聚体被认为能够促进细胞再生，c-Jun同型二聚体可能导致细胞凋亡[23]。

3小结

肝脏IR损伤最初的机制来源于缺血及再灌注刺激后各基因的表达差异，Egr-1、c-Fos、c-Jun表达上调在肝早期应激反应以及后期肝恢复过程中均有体现。这些IEGs对于IR过程的调节与调控组织炎症损伤、再生重建以及能量代谢等相关，但这些机制仍未完全清楚。近年来某些基因治疗药物的问世，如Zolgensma[30]，一种用于治疗脊髓性肌萎缩症基因药物，为临床基因疗法打开了一道曙光。如何通过调节上述基因表达，降低临床上肝脏IR损伤及促进肝恢复仍有一段很长的道路要走。

[参考文献]

[1]Zhang P，Ming Y，Cheng K，et al.Gene expression profiling in ischemic postconditioning to alleviate mouse liver ischemia/reperfusion injury[J].Int J Med Sci，2019，16（2）：343-354.

[2]Wang W，Wu L，Li J，et al.Alleviation of hepatic ischemia reperfusion injury by oleanolic acid pretreating via reducing HMGB1 release and inhibiting apoptosis and autophagy[J].Mediators Inflamm，2019，2019：3 240 713.

[3]Nishii K，Brodin E，Renshaw T，et al.Shear stress upregulates regeneration-related immediate early genes in liver progenitors in 3D ECM-like microenvironments[J].J Cell Physiol，2018，233（5）：4272-4281.

[4]Liang TB，Man K，Kin-Wah Lee T，et al.Distinct intragraft response pattern in relation to graft size in liver transplantation[J].Transplantation，2003，75（5）：673-678.

[5]Santiago FS，Sanchez-Guerrero E，Zhang G，et al.Extracellular signal-regulated kinase-1 phosphorylates early growth response-1 at serine 26[J].Biochem Biophys Res Commun，2019，510（3）：345-351.

[6]Foster AD，Vicente D，Clark N，et al.FTY720 effects on inflammation and liver damage in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury[J].Mediators Inflamm，2019，2019：3 496 836.

[7]张劭，张静.缺血再灌注损伤对大鼠肝细胞周期G2M期相关基因Gadd45a和Egr-1表达的影响[J].中华器官移植杂志，2012，33（8）：466-469.

[8]Rondeau V，Jain A，Truong V，et al.Involvement of the Akt-dependent CREB signaling pathway in hydrogen-peroxide-induced early growth response protein-1 expression in rat vascular smooth muscle cells[J].Can J Physiol Pharmacol，2019， 97（9）：885-892.

[9]Mcmullen MR，Pritchard MT，Wang Q，et al.Early growth response-1 transcription factor is essential for ethanol-induced fatty liver injury in mice[J].Gastroenterology，2005，128（7）：2066-2076.

[23]Schlossberg H，Zhang Y，Dudus L，et al.Expression of c-Fos and c-Jun during hepatocellular remodeling following ischemia/reperfusion in mouse liver[J].Hepatology，1996， 23（6）：1546-1555

[24]Lee YS，Kim YH，Jung YS，et al.Hepatocyte toll-like receptor 4 mediates lipopolysaccharide-induced hepcidin expression[J].Exp Mol Med，2017，49：e408.

[25]Langfermann DS，Schmidt T，R■ssler OG，et al.Calcineurin controls gene transcription following stimulation of a Gαq-coupled designer receptor[J].Exp Cell Res，2019，383（2）：111 553.

[26]Wilhelm A，Aldridge V，Haldar D，et al.CD248/endosialin critically regulates hepatic stellate cell proliferation during chronic liver injury via a PDGF-regulated mechanism[J].Gut，2016，65（7）：1175-1185.

[27]Bakiri L，Hamacher R，Grana O，et al.Liver carcinogenesis by FOS-dependent inflammation and cholesterol dysregulation[J].J Exp Med，2017，214（5）：1387-1409.

[28]Schulien I，Hockenjos B，Schmitt-Graeff A，et al.The transcription factor c-Jun/AP-1 promotes liver fibrosis during non-alcoholic steatohepatitis by regulating Osteopontin expression[J].Cell Death Differ，2019，26（9）：1688-1699.

[29]Starkel P，Horsmans Y，Sempoux C，et al.After portal branch ligation in rat，nuclear factor κb，interleukin-6，signal transducers and activators of transcription 3，c-Fos，c-myc，and c-Jun are similarly induced in the ligated and nonligated lobes[J].Hepatology，1999，29（5）：1463-1470.

[30]夏訓明.美国FDA批准Zolgensma（onasemnogene abeparvovec-xioi）治疗儿童脊髓性肌萎缩症[J].广东药科大学学报，2019，35（3）：332.

（收稿日期：2020-02-19  本文编辑：闫  佩）