血清4-羟基壬烯醛、人软骨糖蛋白-39、肾损伤分子-1诊断早期糖尿病肾病的临床意义研究

余世纪 苏晓清 王桂良

[摘要]目的 探討血清4-羟基壬烯醛（4-HNE）、人软骨糖蛋白-39（YKL-40）、肾损伤分子-1（KIM-1）在糖尿病肾病（DN）早期肾损伤中的临床价值，并分析4-HNE、YKL-40、KIM-1与肾损伤指标、血糖水平、血脂水平的相关性。方法 选取2019年1～7月萍乡市人民医院内分泌科收治的89例2型糖尿病（T2DM）患者，根据24 h尿蛋白排泄率（UAER）结果分为正常蛋白尿组/单纯糖尿病组（NA组）、微量蛋白尿组（MI组）和大量蛋白尿组（MA组）。另选萍乡市人民医院体检科的53例健康体检者作为健康对照组（NC组）。采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测各组血清中的4-HNE、YKL-40、KIM-1浓度。结果 MA组的血清4-HNE、YKL-40、KIM-1高于MI组，差异有统计学意义（P<0.05）;MI组的血清4-HNE、YKL-40、KIM-1高于NA组，差异有统计学意义（P<0.05）;NA、MI、MA组的血清4-HNE、YKL-40、KIM-1均高于NC组，差异有统计学意义（P<0.05）。NA、MI、MA组患者的空腹血糖（FPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、血清肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、UAER均高于NC组，差异有统计学意义（P<0.05）;相关性分析显示，SCr、尿微量蛋白（UmALB）、UAER、FPG、HbA1c与4-HNE、YKL-40、KIM-1成正相关（r=0.428、0.349、0.390，0.501、0.446、0.491，0.478、0.409、0.461，0.414、0.502、0.497，0.584、0.558、0.607;P<0.05）;BUN与4-HNE、YKL-40成正相关（r=0.223、0.176，P<0.05）;低密度脂蛋白（LDL）与4-HNE、YKL-40、KIM-1成负相关（r=-0.169、-0.289、-0.247，P<0.05）。结论 血清4-HNE、YKL-40、KIM-1可作为DN早期诊断的敏感指标，有望为临床中DN的诊断提供依据;血清4-HNE、YKL-40、KIM-1与肾损伤指标、血糖水平成正相关。

[关键词]糖尿病肾病;尿白蛋白;脂质过氧化;氧化应激;生物标志物

[Abstract] Objective To investigate the clinical value of serum 4-hydroxynonenal （4-HNE）， serum human chondroglycoprotein-39 （YKL-40） and kidney injury molecule 1 （KIM-1） in early renal injury of diabetic nephropathy （DN）， and to analyze the correlation of 4-HNE， YKL-40 and KIM-1 with renal injury index， blood glucose and lipid level. Methods A total of 89 patients with type 2 diabetes mellitus （T2DM） hospitalized in the Department of Endocrinology of Pingxiang People′s Hospital from January to July in 2019 were selected， and the patients were divided into normal albuminuria group or only diabetes group （group NA）， microalbuminuria group （group MI） and macro albuminuria group （group MA） according to the 24 h urinary protein excretion rate （UAER）. In addition， 53 healthy patients in the Physical Examination Department of Pingxiang People′s Hospital were selected as the normal control group （NC）. Serum concentrations of 4-HNE， YKL-40 and KIM-1 were determined by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Results The serum 4-HNE， YKL-40 and KIM-1 in the group MA were higher than those in the group MI， with statistically significant differences （P<0.05）. The serum 4-HNE， YKL-40 and KIM-1 in the group MI were higher than those in the group NA， with statistically significant difference （P<0.05）. The serum 4-HNE， YKL-40 and KIM-1 in the groups NA， MI and MA were higher than those in the group NC， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The fasting blood glucose （FPG）， glycosylated hemoglobin （HbA1c）， serum creatinine （SCr）， blood urea nitrogen （BUN）， UAER indexes in groups NA， MI MA were higher than those in group NC， with statistically significant differences （P<0.05）. Correlation analysis showed that SCR， BUN， Urinary microprotein （UmALB）， UAER， FPG and HbA1c were positively correlated with 4-HNE， YKL-40 and KIM-1 （r=0.428， 0.349， 0.390; 0.501， 0.446， 0.491; 0.478， 0.409， 0.461; 0.414， 0.502， 0.497; 0.584， 0.558， 0.607; P<0.05）. BUN was positively correlated with 4-HNE and YKL-40 （r=0.223， 0.176; P<0.05）. Low density lipoprotein （LDL） was negatively correlated with 4-HNE， YKL-40 and KIM-1 （r=-0.169， -0.289， -0.247; P<0.05）. Conclusion 4-HNE， YKL-40 and KIM-1 can be used as a sensitive indicator for the early diagnosis of DN， and is expected to provide a basis for the diagnosis of DN in clinical practice. Serum 4-HNE， YKL-40 and KIM-1 are positively correlated with renal injury index and blood glucose level.

[Key words] Diabetic nephropathy; Urinary albumin; Lipid peroxidation; Oxidative stress; Biomarker

糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）的慢性并发症之一，据统计，DM患者40%以上可出现肾损害，DN的治疗已成为一个日益严重的挑战，通过积极干预控制血糖刻不容缓[1]。Wang等[2]的研究显示，血液动力学异常、高血糖诱导的代谢紊乱和炎症因子之间相互作用构成了DN的病理生理学基础，故推测DN发病及进展与血糖长期升高及活性氧（ROS）有关。临床调查发现[3]，DN存在相对较长的无临床表现期，继而在无DN相关临床表现的情况下通过尿液检测出尿微量蛋白（UmALB），最终导致终末期肾病（ESRD）。尽管目前临床上大多以检测UmALB作为DN的早期诊断方法，但UmALB并不敏感，并且在伴有组织损伤和炎症的DM患者尿液检测可出现UmALB。肾穿刺是DN诊断的金标准，但其为一种侵入性检查方法，因此临床应用受限[4]。故需寻找新的诊断指标检测早期DN，减少ESRD发生。

相关研究表明，DM大鼠随肾脏损伤逐渐加重，血清4-羟基壬烯醛（4-HNE）表达水平逐渐升高，并提示脂质过氧化参与DN进展[5];Han等[6]研究认为血清人软骨糖蛋白-39（YKL-40）参与了DN肾脏损伤的过程，且与尿蛋白排泄率（UAER）成正相关;而血清肾损伤分子-1（KIM-1）能较快反映DN早期肾脏损伤[7]。目前，研究血清4-HNE、YKL-40、KIM-1表达水平在早期DN诊断中的临床意义的相关研究较少。本研究主要观察血清4-HNE、YKL-40、KIM-1对评价DN肾脏早期病理损害的临床意义，并分析血清4-HNE、YKL-40、KIM-1与肾损伤检测指标、血糖水平、血脂水平的相关性，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2019年1～7月萍乡市人民医院内分泌科收治的89例2型糖尿病（T2DM）患者，其中男43例，女46例;年龄28～77岁，平均（57.0±8.8）岁。患者均通过连续两次24 h尿蛋白定量检查，结果以两次平均值计算24 h UAER，根据24 h UAER结果将患者分为正常蛋白尿组/单纯糖尿病组（NA组，UAER<20 μg/min）、微量蛋白尿组（MI组，UAER 20～<200 μg/min）和大量蛋白尿组（MA组，UAER≥200 μg/min）。NA组30例，男11例，女19例;年龄55.50（50.0，61.25）岁。MI组35例，男17例，女18例;年龄56（50.00，66.00）岁;MA组24例，男15例，女9例;年龄60（52.25，66.00）岁。

另选萍乡市人民医院体检科的53例健康体检者作为健康对照组（NC组），其中男27例，女26例;年龄27～70岁，平均（55.0±9.8）岁。

各组的性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究已经萍乡市人民医院医学伦理委员会审核批准。

1.2纳入及排除标准

纳入标准：①DM患者均为参照1999年世界卫生组织糖尿病专家委员会制定的诊断标准确定的T2DM患者，且病程<15年;②血压≤140/90 mmHg，三酰甘油（TG）≤5.0 mmol/L，糖化血红蛋白（HbA1c）≤12%者。

排除标准：①存在其他因素所致的肝、肾脏疾病，严重的心脑血管疾病、1型糖尿病、肿瘤、妊娠、合并炎症及晨起剧烈运动的患者;②吸烟者;③近期有糖尿病酮癥酸中毒、高渗性昏迷者。

1.3方法

1.3.1试剂与仪器  ①4-HNE、YKL-40、KIM-1检测试剂盒购于上海极威生物科技有限公司，均按照试剂盒说明操作;②全自动蛋白分析仪（贝克曼库尔特型号IMMAGE800）;③全自动生化分析仪（贝克曼库尔特 LX20）;④全自动糖化分析仪（成都柯尼特科技有限公司型号Premier Hb9210）;⑤酶标仪、洗板机（雷杜生命科学股份有限公司型号RT-6100、RT-3100）。

1.3.2样本采集  研究对象均空腹12 h采集静脉血3 ml，3000 r/min离心10 min;收集血清冻存于-80℃冰箱。

1.3.3相关指标浓度测定  ①采用ELISA法检测各组血清标本中的4-HNE、YKL-40、KIM-1浓度;②采用免疫比浊法检测UmALB;③HbA1c：高效液相色谱法;④UAER：双缩脲法;⑤空腹血糖（FPG）：葡萄糖氧化酶法;⑥血清肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、TG采用酶法测定。

1.4观察指标

①观察四组的肾损伤指标，主要包括BUN、SCr、24 h UAER及UmALB;②比较四组的血糖及血脂指标水平，血糖指标主要包括FPG及HbA1c，血脂指标包括LDL、HDL、TG;③比较四组的血清4-HNE、YKL-40、KIM-1表达水平。

1.5统计学方法

采用SPSS 24.0统计学软件对数据进行分析，定性资料以频数表示，组间比较采用χ2检验;符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），差异有统计学意义再行SNK法多重比较;不符合正态分布的以中位数M（P25，P75）表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H非参数检验，差异有统计学意义再行Nemenyi法多重比较;相关性采用Pearson相关系数表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1四组肾功能指标的比较

MI、MA组患者BUN高于NA、NC组，差异有统计学意义（P<0.05）;MI组与MA组患者BUN比较，差异无统计学意义（P>0.05）;NA组与NC组BUN比较，差异无统计学意义（P>0.05）;MI、MA组患者SCr、UAER及UmALB高于NA、NC组，MA组患者SCr、UAER及UmALB高于MI组，差异有统计学意义（P<0.05）;NA组与NC组SCr、UAER、UmALB比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

2.2四组血糖及血脂指标水平的比较

NA、MI、MA组的FPG、HbA1c高于NC组，差异有统计学意义（P<0.05）;NA、MI、MA组的FPG、HbA1c比较，差异无统计学意义（P>0.05）;MA组的LDL低于NC组，差异有统计学意义（P<0.05）;四组的HDL、TG比较，差异均无统计学意义（P>0.05）（表2）。

2.3四组血清4-HNE、YKL-40、KIM-1水平的比较

NA、MI、MA组患者的血清4-HNE、YKL-40、KIM-1水平高于NC组，MI、MA组患者的血清4-HNE、YKL-40、KIM-1水平高于NA组，MA组患者的血清4-HNE、YKL-40、KIM-1水平高于MI组，差异均有统计学意义（P<0.05）（表3，图1）。

2.4临床生化指标与4-HNE、YKL-40、KIM-1的相关性分析

SCr、UmALB、UAER、FPG、HbA1c与4-HNE、YKL-40、KIM-1成正相关（r=0.428、0.349、0.390，0.501、0.446、0.491，0.478、0.409、0.461，0.414、0.502、0.497，0.584、0.558、0.607;P<0.05）;BUN与4-HNE、YKL-40成正相关（r=0.223、0.176，P<0.05）;LDL与4-HNE、YKL-40、KIM-1成负相关（r=-0.169、-0.289、-0.247，P<0.05）（表4）。

3讨论

高糖状态可使细胞氧化应激、脂质过氧化水平升高，而脂质过氧化的亚稳态醛可作为第二信使，刺激多种细胞产生炎症甚至细胞凋亡，提升氧化应激水平[8]，致ROS过表达，刺激细胞膜上磷脂双层的多不饱和脂肪酸结构上的氢以诱发脂质过氧化，使4-HNE过表达，影响细胞信号转导，从而导致细胞凋亡和肾脏病理损伤[9-10]。Chen等[11]研究显示，当4-HNE处于低浓度时可能发挥抗氧化作用，降低氧化应激对肾脏造成的损伤。此外，高糖状态时，血清4-HNE与肾脏损伤程度成正相关[12]，故DN早期通过检测4-HNE可避免发生肾脏不可逆损伤。

YKL-40由单核细胞向巨噬细胞分化产生，活化的巨噬细胞具有分泌YKL-40的功能，当血脂水平升高合并斑块血管时，巨噬细胞和血管平滑肌细胞（VSMCs）中存在YKL-40表达[13]。VSMCs通过外源性信号诱导迁移至细胞内膜，而YKL-40通过刺激VSMCs迁移和重组，以调节血管内皮细胞的形态[14]，促进分支小管的形成。此外，Rathcke等[13，15]的研究显示，YKL-40表达水平与内皮功能障碍程度成正相关，参与早期内皮功能损伤，并与DN肾损伤程度成正相关，提示YKL-40具有早期发现DN肾脏损伤的作用。

KIM-1是一类跨膜糖蛋白，具有膜结构域和胞质结构域，包含两个同源基因KIM-1a和KIM-1b[16]，且同源基因具有不同的细胞质结构域。Lim等[17]研究认为高糖、肥胖等代谢因素可导致肾脏局部氧化应激、ROS形成增加，使血清KIM-1表达升高，提示其与局部肾损伤机制相关。Sabbisetti等[18]研究对DN患者进行观察，发现血清KIM-1表达水平与肾小球滤过率估值下降率密切相关，并发现KIM-1在肾缺血早期存在表达，且与肾脏病理损伤程度成正相关，故推测KIM-1早期可间接反应肾脏病理损伤。

本研究结果显示，NA、MI、MA组患者的血清4-HNE、YKL-40、KIM-1水平高于NC組，MI、MA组患者的血清4-HNE、YKL-40、KIM-1水平高于NA组，MA组患者的血清4-HNE、YKL-40、KIM-1水平高于MI组，差异均有统计学意义（P<0.05）;血清4-HNE、YKL-40、KIM-1在NC组表达水平极低，NA组UmALB、SCr等肾脏损伤指标维持正常范围时，血清4-HNE、YKL-40、KIM-1已开始表达，且随着DN患者蛋白尿逐渐增多，患者血清4-HNE、YKL-40、KIM-1的表达进一步升高，提示血清4-HNE、YKL-40、KIM-1的表达水平与DM肾脏损害程度有关，对DN的早期肾脏病变起到预测作用。

本研究结果显示，FPG、HbA1c与4-HNE、YKL-40、KIM-1成正相关（r=0.414、0.502、0.497，0.584、0.558、0.607;P<0.05），提示长期维持血糖稳定可显著降低4-HNE、YKL-40、KIM-1的表达，减轻DN患者肾脏损伤的程度。此外，NA、MI、MA组的FPG、HbA1c高于NC组，差异有统计学意义（P<0.05）;NA、MI、MA组的FPG、HbA1c比较，差异无统计学意义（P>0.05），考虑可能因DM患者晚期接受胰岛素降糖治疗的依从性相对较高所致。SCr、UmALB、UAER与4-HNE、YKL-40、KIM-1成正相关（r=0.428、0.349、0.390，0.501、0.446、0.491，0.478、0.409、0.461;P<0.05）;BUN与4-HNE、YKL-40成正相关（r=0.223、0.176，P<0.05），提示4-HNE、YKL-40、KIM-1与肾脏损伤程度成正相关，但NA组与NC组的SCr、UAER、UmALB比较，差异无统计学意义（P>0.05），NA组与NC组的BUN比较，差异无统计学意义（P>0.05），推测SCr、BUN、UmALB在DN早期并不能准确判断患者的肾脏病变程度。4-HNE、YKL-40、KIM-1与LDL成负相关（r=-0.169、-0.289、-0.247，P<0.05），与HDL、TG无相关性（P>0.05）;MA组的LDL低于NC组，差异有统计学意义（P<0.05），并且四组的HDL、TG比较，差异均无统计学意义（P>0.05），提示血脂水平不能间接反应肾损伤程度，考虑与临床降脂药物治疗影响血脂水平有关。

目前，UmALB是临床诊断早期肾脏损害的无创诊断方法，但并不敏感，易受到运动、感染、高血压等因素干扰，而24 h UAER检测在门诊工作中的依从性甚差，故血清4-HNE、YKL-40、KIM-1可作为诊断早期DN的敏感、可重复性、无创的检测指标，具有一定的临床价值。

[参考文献]

[1]Figueroa-Pérez，Marely G，Pérez-Ramírez，et al.Diabetic nephropathy is ameliorated with peppermint （Mentha piperita） infusions prepared from salicylic acid-elicited plants[J].J Funct Foods，2018，43：55-61.

[2]Wang M，Wang S，Yao D，et al.A novel long non-coding RNA CYP4B1-PS1-001 regulates proliferation and fibrosis in diabetic nephropathy[J].Mol Cell Endocrinol，2016，426：136-145.

[3]Bjornstad P，Cherney D，Maahs DM.Early diabetic nephropathy in type 1 diabetes-new insights[J].Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes，2014，21（4）：279-286.

[4]Wang J，Wang G，Liang Y，et al.Expression profiling and clinical significance of plasma microRNAs in diabetic nephropathy[J].Diabetes Res，2019，2019：5 204 394.

[5]刘桂美，季文萱，黄俊彦，等.4羟基壬烯醛在糖尿病大鼠肾脏中的表达及意义[J].中国中西医结合肾病杂志，2013， 14（9）：773-775.

[6]Han JY，Ma XY，Yu LJ，et al.Correlation between serum YKL-40 levels and albuminuria in type 2 diabetes[J].Genet Mol Res，2015，14（4）：18 596-18 603.

[7]黄炎，章爽，黄伟，等.肾损伤分子-1在糖尿病肾脏早期损伤中的诊断价值研究[J].中国实验诊断学，2017，21（8）：1299-1302.

[8]Ramana KV，Srivastava SK，Ansari NH，et al.4-Hydroxynonenal in the pathogenesis and progression of human diseases[J].Curr Med Chem，2014，21（2）：230-237.

[9]Liu G，Ji W，Huang J，et al.4-HNE expression in diabetic rat kidneys and the protective effects of probucol[J].J Endocrinol Invest，2016，39（8）：865-873.

[10]Fritz KS，Galligan JJ，Smathers RL，et al.4-Hydroxynonenal inhibits SIRT3 via thiol-specific modification[J].Chem Res Toxicol，2011，24（5）：651-662.

[11]Chen ZH ，Niki E.4-Hydroxynonenal （4-HNE） has been widely accepted as an inducer of oxidative stress.Is this the whole truth about it or can 4-HNE also exert protective effects？[J].IUBMB Life，2010，58（5-6）：372-373.

[12]席悦.西格列汀对糖尿病肾损伤的保护作用研究[D].北京：中国人民解放军医学院，2014.

[13]Rathcke CN，Vestergaard H.YKL-40，a new inflammatory marker with relation to insulin resistance and with a role in endothelial dysfunction and atherosclerosis[J].Inflamm Res，2006，55（6）：221-227.

[14]Malinda KM，Ponce L，Kleinman HK，et al.Gp38k，a protein synthesized by vascular smooth muscle cells，stimulates directional migration of human umbilical vein endothelial cells[J].Exp Cell Res，1999，250（1）：168-173.

[15]Mahdy RA，Nada WM，Hadhoud KM，et al.The role of vascular endothelial growth factor in the progression of diabetic vascular complications[J].Eye（London，England），2010，24（10）：1576-1584.

[16]Ismail OZ，Zhang X，Bonventre JV，et al.G protein α12（Gα12） is a negative regulator of kidney injury molecule-1-mediated efferocytosis[J].AJP Renal Physiology，2015， 310（7）：607–620.

[17]Lim AI，Tang SCW，Lai KN，et al.Kidney injury molecule-1：more than just an injury marker of tubular epithelial cells？[J].J Cell Physiol，2013，228（5）：917-924.

[18]Sabbisetti VS，Waikar SS，Antoine DJ，et al.Blood kidney injury molecule-1 is a biomarker of acute and chronic kidney injury and predicts progression to ESRD in type Ⅰ diabetes[J].J Am Soc Nephrol，2014，25（10）：2177-2186.

（收稿日期：2019-10-11  本文編辑：闫  佩）