伤科解毒颗粒的提取工艺研究

王小新 韦玉燕 何 科

广西壮族自治区玉林市中西医结合骨科医院药剂科，广西玉林 537000

目前致病菌的耐药情况越来越严峻，国家对于抗菌药物的监管也越来越严格，这对于抗菌中药的研发带来了很好的机会。伤科解毒方是我院根据骨伤科手术特点拟定的中药复方，是五味消毒饮合桃红四物汤加柴胡、延胡索而成，用于预防和治疗骨科术后细菌感染和下肢静脉血栓。本方在临床上已使用多年，治疗效果确切，现欲开发成伤科解毒颗粒，以方便患者服用和携带。制剂的提取工艺筛选是以有效成分的最大提取量为目标，其中传统的干膏得率是作为制剂有效成分总提取量的指标，体现了中药复方多通路、多靶点治疗疾病的特点。高效液相色谱法测定制剂中的有效成分含量可以考察制剂成分的稳定性，具有快速、简便、准确的特点[1]。本实验以干膏质量分数和绿原酸质量分数为考察指标，对优化伤科解毒颗粒的提取工艺进行综合考察，旨在为其日后的开发利用提供科学的基础数据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-20高效色谱仪及紫外检测器（日本岛津）；C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×150 mm，武汉恒信世纪科技有限公司）；AB201-S型电子分析天平（梅特勒托利多仪器有限公司）；JJ1000型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）；KQ-50E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；101-1-S型电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）；ZF-20D型暗箱式紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂）；AK400A型中药粉碎机（温岭市奥力药材器械厂）；HH-S4数显恒温水浴锅（金坛市医疗器械厂）。

1.2 试药

绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号为110753-201415）；所有药材均购自广西张益堂中药饮片有限公司，经鉴定均符合《中国药典》2015年版（一部）标准；高效液相所用乙腈、甲醇均为色谱纯，水为哇哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 干膏的制作计算方法

浓缩滤液至100 ml，精密量取20 ml置于已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，残渣置105℃烘箱中烘4 h，置干燥缸中冷却30 min，精密称重。

2.2 绿原酸的含量测定方法

2.2.1 色谱条件[2]检测波长：327 nm；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（13∶87）；体积流量：1 ml/min；柱温：常温；进样量：20 μl。

2.2.2 供试品溶液的制备[3-4]精密称取样品干膏0.2 g至锥形瓶中，加入50%甲醇溶液100 ml，超声30 min，过滤，滤液用50%甲醇定容至100 ml，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，即得。

2.2.3 标准品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品，用甲醇制成浓度为15.04 μg/ml的溶液，即得。

2.2.4 精密度试验[5]取高（60.60 μg/ml）、中（20.78 μg/ml）、低 （8.22 μg/ml）3种质量浓度的绿原酸对照品溶液，重复进样6次，测得峰面积RSD均＜2%，提示仪器精密度良好。

2.2.5 重复性试验[6]精密量取供试品储备液10 ml，按“2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液，在“2.2.1”项下色谱条件下测定，测得绿原酸含量RSD为2.2%，提示该方法重复性良好。

2.2.6 稳定性试验[7]取“2.2.2”项下供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下每3小时测定 1次， 即 0、3、6、9、12 h进行测定，测得绿原酸峰面积RSD为1.73%，提示供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.2.7 加样回收率试验[8]取“2.2.2”项下方法制备的同一批供试液9份，加入相当于对照品溶液80%、100%、120%的量，在“2.2.1”项色谱条件下测得绿原酸的平均加样回收率为99.91%，RSD为0.79%（表1）。

2.2.8 标准曲线的绘制[9]精密称取绿原酸标准品4.7 mg，置于 25 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀至完全溶解，即得质量浓度为0.188 mg/ml的对照品母液。使用时用移液管精密吸取对照品母液2～25 ml的容量瓶，用50%的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜滤过即得浓度为15.04 μg/ml的对照品溶液。分别进样 5、10、15、20、25、30 μl， 用高效液相色谱仪测得绿原酸峰面积。以绿原酸的质量浓度为横坐标，测得峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：Y=3×106X+1486，r=1。结果提示绿原酸质量浓度范围在75.2～451.2 μg/ml与峰面积呈良好的线性关系。

表1 加样回收试验结果

2.2.9 定量测定 精密吸取供试品溶液20 μl进样，用高效液相色谱仪分析测得绿原酸峰面积，计算绿原酸质量分数。绿原酸对照品与样品的色谱图如图1。

图1 绿原酸标准品和样品的色谱图

2.3 综合评分的计算方法

根据处方中各药味的配比以及作用功效，设定干膏质量分数重权重系数为0.7，绿原酸质量分数为0.3。综合评分=干膏质量评分×0.7+绿原酸含量评分×0.3。 其中干膏质量分数评分为=（x-xmin）/（xmax-xmix），绿原酸质量量分数评分=（y-ymin）/（ymax-ymix），x 为绿原酸质量分数，y为干膏质量分数[10]。

2.4 单因素考察[11-13]

2.4.1 吸水率考察 取处方量各药材加10倍水，浸泡24 h，滤过，剩余湿药材称重。吸水率（按重量计算）=（湿药材总重-干药材总重）/干药材总重。计算结果吸水率为2.29 g/g。

2.4.2 浸泡时间考察 称取处方量各药材加20倍水，分别浸泡 5、15、30、45、60 min，煎煮 90 min，滤过，滤液按“2.1”所述方法制成干膏，精密称取0.2 g干膏，按“2.2”所述方法进行高效液相色谱测定，结果见表2。根据实验结果，选取浸泡时间15、30、45 min作为正交考察水平。

表2 浸泡时间考察结果

2.4.3 加水倍数考察 称取处方量各药材，药材分别加入 18、21、24、28、30 倍水量浸泡 45 min，煎煮 90 min，趁热过滤，滤液按“2.1”项制作干膏。精密称取干膏0.2 g，按“2.2”项进行高效液相色谱分析，计算绿原酸的质量分数，结果如表3。根据实验结果，选取加水量21、24、28倍作为正交试验考察水平。

表3 加水倍数考察结果

2.4.4 煎煮时间考察 称取处方量各药材，加24倍水浸泡 45 min，分别煎煮 30、60、90、120、150 min，滤过，滤液按 “2.1”项制作干膏。精密称取干膏0.2 g，按“2.2”项进行高效液相色谱分析，计算绿原酸的质量分数，结果如表4。根据实验结果，选取煎煮时间90、120、150 min作为正交试验考察水平。果选定3个水平进行考察，具体见表5。

表4 煎煮时间考察结果

2.5 正交试验

称取处方量各药材，按正交试验表L9（34）进行试验。考察因素有加水倍数（A）、浸泡时间（B）、煎煮时间（C）和煎煮次数（D），每个因素根据单因素实验结

表5 正交试验的考察因素和考察水平

以干膏的质量分数和绿原酸的质量分数作为考察指标，以综合评分对实验结果进行直观分析和方差分析，结果见表6、表7。

表6 正交实验方案及结果分析

表7 综合评分方差分析表

由综合评分的直观分析以及方差分析可知，A因素应选取 A2，B因素应选取 B3，C因素应选取 C2，D因素应选取D2，即最佳提取工艺为A2B3C2D2，即加入24倍水量，浸泡45 min，煎煮时间为2 h，煎煮2次，每次1 h。

2.6 提取工艺验证

称取处方量各药材，按上述实验所得最佳工艺重复进行3次试验，其结果如表8。3次的提取工艺验证试验，各指标略高于正交试验，干膏质量分数和绿原酸质量分数平均值为0.31 g/g和5.44 mg/g，RSD分别为1.9%和3.1%，均＜5%，结果差异较小，提示正交试验结果筛选的最佳提取工艺稳定可靠。

表8 提取工艺验证结果

3 讨论

伤科解毒方是我院临床使用多年的经验方，在五味消毒饮合桃红四物汤的基础上加味柴胡、醋延胡索而成。方中五味消毒饮出自吴谦《医宗金鉴》，是清热解毒的著名方剂，由金银花、紫花地丁、蒲公英、野菊花、青天葵组成，临床多用于疔毒、痈疡疮疖等。文献报道，五味消毒饮有广谱抗菌作用，其水煎液对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、四联球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌普遍具有抗菌作用[14]。桃红四物汤源于清初吴谦的《医宗金鉴·正骨心法要旨》，为养血补血活血的基础方，是遵循“活血化瘀”的原则所组成的治疗骨折基本方，实验显示，桃红四物汤能明显改善骨折早期疼痛、肿胀等症状，同时对瘀斑、局部压痛等体征亦有加速恢复的作用，其作用强于常规治疗组[15]，因此伤科解毒颗粒具有预防和治疗骨科术后感染及下肢静脉血栓的双重功效。开发伤科解毒颗粒具有巨大的临床应用价值和市场经济价值。

在中药制剂的研发过程中，以什么指标去考察各工艺的水平非常重要。中药成分复杂，作用机制多样，具有多通路、多靶点的特点，所以干膏得率是衡量中药物质成分的有效指标，所以本文选取干膏作为考察指标之一，并且给予0.7的权重系数，反映了中药制剂总有效物质在治疗效果中占的主导作用。中药制剂中具体有效成分的含量测定，可以衡量其质量是否达到要求及产品是否稳定。高效液相色谱法具有柱效高、灵敏度高、分离速度快、适用范围广、重现性好、操作方便等优点[1]，在中药有效成分的含量测定中具有突出优势，成为中药成分质量控制的重要手段。金银花作为伤科解毒颗粒中的君药，具有清热解毒、疏散风热的作用，其主要有效成分为绿原酸，所以试验以绿原酸的含量作为考察指标。参考《中国药典》2015版中金银花下绿原酸的色谱条件，对伤科解毒颗粒进行含量测定，其绿原酸峰分离度较好，各项指标均符合要求，故试验选用此色谱条件。本实验对干膏质量分数和绿原酸质量分数两个考察指标进行综合评分，筛选最优工艺，经过验证试验，证明最优工艺稳定可行，可以确保伤科解毒颗粒的有效性，这为后续的研究提供了基础实验数据。