黄连素对2型糖尿病大鼠胸主动脉PI3K/Akt/eNOS信号通路的影响

封 芬 谭安雄 邓集湘 周 斌

1.邵阳学院药学院，湖南邵阳 422000；2.湖南省邵阳市中心医院内分泌科，湖南邵阳 422000

[关健词]黄连素；糖尿病；大血管病变；血脂；PI3K；Akt；eNOS

目前，糖尿病的患病率持续增长，2013年，我国成人糖尿病患者已达人口总数的10.4%[1]。大血管病变作为糖尿病的主要慢性并发症，是患者死亡的主要原因[2]，而血管内皮功能障碍和动脉粥样硬化是糖尿病大血管病变的主要病理表现[3]。近年来的研究显示，我国传统中药黄连素在降血糖、调血脂等方面具有显著功效[4-5]，黄连素能改善血管内皮功能，减轻动脉球囊引起的血管内皮损伤[6]。纵观国内外研究报道，对黄连素保护糖尿病大血管方面的信号机制研究较少。有学者发现，肌肉因子Irisin、藻酸双酯钠纳米剂型、红景天苷等可通过上调PI3K/Akt/eNOS信号途径，改善糖尿病血管内皮功能[7-9]，故推测黄连素对糖尿病大血管的保护作用有可能与PI3K/Akt/eNOS信号通路有关。本实验从黄连素对2型糖尿病大鼠糖、脂代谢及胸主动脉PI3K/Akt/eNOS信号通路的影响着手，探讨其对糖尿病大血管病变的防治机制。

1 材料及方法

1.1 实验动物和饲料

清洁级 SD 大鼠[60 只，雄性，体质量（190±10）g]、普通饲料、高糖高脂饲料（含58.5%普通饲料、20%蔗糖、18%炼猪油、0.5%胆酸、3%胆固醇）均由湖南长沙市天勤生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2014-0011。

1.2 主要药物和试剂

黄连素和链脲佐菌素为北京北实纵横科技发展有限公司产品；盐酸二甲双胍为山东东方福瑞达制药有限公司产品；p-eNOS（Ser1177）一抗和p-PI3K-p85一抗为 Cell Signaling Technology公司产品；p-Akt（Ser473）一抗、山羊抗兔及山羊抗小鼠二抗为江苏碧云天生物技术研究所产品；一氧化氮（NO）硝酸还原酶法检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；PVDF膜和β-actin抗体购自北京索莱宝科技有限公司；蛋白质检测BCA试剂盒为Pierce公司产品，ECL化学发光试剂盒为Santa Cruz公司产品。

1.3 主要仪器

日立7020型全自动生化分析仪（日本日立高新技术有限公司），超低温冰箱（日本Sanyo公司），强生稳步倍加型血糖仪（美国Lifescan公司），高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），垂直电泳及转膜系统（美国Bio-Rad公司），SynergyTM HT多功能酶标仪（Bio-Tek公司），AlphalmagerTM2200凝胶成像系统（美国Alpha Innotech公司）。

1.4 动物造模及分组

将60只SD大鼠随机分为正常组（n=10）和实验组（n=50），前者饲喂普通饲料，后者饲喂高糖高脂饲料。4周后大鼠禁食12 h，实验组大鼠腹腔注射链脲佐菌素30 mg/kg（用pH为4.4的0.1 mol/L枸橼酸缓冲液溶解），正常组腹腔注射等量的枸橼酸缓冲液，7 d后均重复注射1次。2周后，断尾取血测空腹血糖（fasting blood-glucose，FBG）， 以 FBG≥11.1 mmol/L视为2型糖尿病大鼠造模成功[10]。将30只2型糖尿病大鼠随机分为二甲双胍组（阳性对照药）、黄连素组和模型组各 10 只，分别以二甲双胍[200 mg/（kg·d）]、黄连素[150 mg/（kg·d）]和生理盐水[10 mg/（kg·d）]灌胃，每天注意观察大鼠摄食、饮水、排便等情况，继续喂养8周。

1.5 生化指标检测

药物干预结束后禁食12 h，剪尾采血，用血糖仪检测FBG。然后麻醉大鼠，腹主动脉取血分离血清，-80℃保存，用于检测一氧化氮（NO）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）水平。NO按照试剂盒说明书操作步骤进行检测，TC、TG、LDL-c、HDL-c 用全自动生化分析仪进行检测。

1.6 胸主动脉形态学观察

腹主动脉取血后即刻分离胸主动脉，剪成两段，分别予HE染色和-80℃保存。立即将一段胸主动脉予10%中性甲醛固定、脱水、透明、石蜡包埋、切片，经苏木精-伊红染色（HE染色）后观察显微镜下的形态学改变。

1.7 免疫印迹法检测胸主动脉p-PI3K-p85、p-Akt、peNOS等蛋白表达

取出低温保存的大鼠胸主动脉，裂解、冰浴匀浆后，低温高速离心，去除沉淀，BCA法测定蛋白浓度，加上样缓冲液后加热变性。取50 μg蛋白上样，在10%SDS-PAGE凝胶上进行电泳。半干式电转至PVDF膜，5%脱脂牛乳室温下缓慢轻摇封闭2 h，加入一抗后于4℃孵育过夜。次晨TBST洗膜，10 min/次，共3次。加入二抗，室温缓慢轻摇孵育40 min，TBST洗膜，15 min/次，共3次。暗室内加入超敏发光剂，X线胶片曝光。用AlphalmagerTM2200凝胶成像系统分析p-PI3K-p85、p-Akt、p-eNOS 等蛋白条带灰度值。

1.8 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验期间大鼠情况

正常组大鼠体质量渐增，皮毛润滑，摄食饮水量适中，大小便及活动正常。模型组大鼠体质量渐减，毛色枯黄，摄食饮水量及小便增多，精神萎靡懒动。二甲双胍组和黄连素组大鼠糖尿病症状轻于模型组。

2.2 各组大鼠FBG及血清NO水平的比较

模型组大鼠的FBG水平高于正常组，血清NO水平低于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01）；黄连素组及二甲双胍组的FBG水平低于模型组，血清NO水平高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）（表 1）。

表1 各组大鼠FBG和血清NO水平的比较（n=10，±s）

表1 各组大鼠FBG和血清NO水平的比较（n=10，±s）

与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01

组别 剂量（mg/kg） FBG（mmol/L） NO（μmol/L）正常组模型组二甲双胍组黄连素组--200 150 4.87±1.14 25.23±4.01*11.18±3.01*△13.75±2.84*△35.72±4.35 20.07±3.30*29.02±3.98*△26.56±4.48*△

2.3 各组大鼠血清TG、TC、LDL-c及HDL-c水平的比较

模型组的TG、TC、LDL-c水平高于正常组，HDL-c水平低于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01）。黄连素组及二甲双胍组的TG、TC、LDL-c水平低于模型组，HDL-C水平高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）。黄连素组的TC水平高于二甲双胍组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表 2）。

表2 各组大鼠血清TG、TC、LDL-c及HDL-c水平的比较（n=10，±s）

表2 各组大鼠血清TG、TC、LDL-c及HDL-c水平的比较（n=10，±s）

与正常组比较，#P＜0.05，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；与二甲双胍组比较，▲P＜0.05

组别 剂量（mg/kg）TG（mmol/L）TC（mmol/L）LDL-c（mmol/L）HDL-c（mmol/L）正常组模型组二甲双胍组黄连素组--200 150 0.71±0.13 2.22±0.30*1.86±0.25*△1.92±0.20*△1.32±0.11 3.86±0.32*2.56±0.31*△2.82±0.21*△▲1.08±0.11 2.63±0.28*1.76±0.28*△1.94±0.30*△1.11±0.10 0.75±0.09*0.96±0.08#*△0.89±0.08*△

2.4 大鼠胸主动脉形态学观察

正常组大鼠胸主动脉中膜层弹力板与平滑肌细胞排列有序，内膜平整光滑。模型组内膜不连续且明显增厚，并有内皮细胞坏死脱落现象。二甲双胍组和黄连素组病变程度明显轻于模型组，内膜较光滑平整，内皮细胞坏死脱落较少（图1）。

图1 各组大鼠胸主动脉形态学变化（HE染色，200×）

2.5 大鼠胸主动脉p-eNOS、p-PI3K-p85和p-Akt蛋白表达

模型组胸主动脉的p-eNOS、p-PI3K-p85和p-Akt表达低于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01）；黄连素组和二甲双胍组胸主动脉的p-eNOS、p-PI3K-p85和p-Akt表达高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）（图 2）。

图2 各组大鼠胸主动脉p-eNOS、p-PI3K-p85和p-Akt等蛋白的表达

3 讨论

黄连素具有显著的抑菌作用，常用于治疗细菌性胃肠炎。近年来报道，黄连素也具有内分泌及心血管系统方面的药理作用[10]。黄连素能明显降低糖尿病大鼠餐后血糖及空腹血糖[11]，能降低高脂血症大鼠血脂水平[12]。本实验通过腹腔注射链脲佐菌素，结合高糖高脂饲料喂养的方法建立2型糖尿病大鼠模型[13]。黄连素组大鼠经黄连素治疗后，糖尿病症状明显减轻。与模型组大鼠相比，黄连素组的FBG、TG、TC、LDL-c水平明显降低，HDL-c 水平明显升高（P＜0.01），提示黄连素具有较好的降血糖及调血脂作用，与国内外报道相似。

NO为血管舒张因子，是反映血管内皮功能的常用指标。研究显示，糖尿病、高血脂可导致血管内皮功能受损，NO合成分泌减少[14]，而内皮细胞损伤是糖尿病大血管病变的关键触发因素[3]。本实验模型组大鼠胸主动脉内膜受损明显，血清NO水平明显低于正常组，而 FBG、TC、TG、LDL-c 水平明显高于正常组（P＜0.01），提示在高糖高脂的刺激下，2型糖尿病大鼠出现了大血管病变。与模型组相比，黄连素组大鼠的血清 NO 水平升高，血糖、血脂水平降低（P＜0.01），胸主动脉内皮病变改善，提示黄连素可能通过改善糖脂代谢，缓解血管内皮受损，保护糖尿病大血管。

磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）是由催化亚基p110和调节亚基p85组成的异二聚体[15]。Akt是PI3K信号通路下游的重要靶蛋白，PI3K/Akt信号通路与糖代谢、细胞增殖、分化等生命活动密切相关[16]。

内皮型一氧化氮合酶 （endothelin nictric oxide synthase，eNOS）是合成NO的限速酶，为内皮功能完整的标志之一[17]。研究显示，脂肪因子vaspin可通过激活PI3K/Akt/eNOS途径改善高葡萄糖诱导的内皮组细胞功能障碍[18]；6-姜酚可通过激活PI3K/Akt/eNOS信号通路，减轻高葡萄糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤[19]。上述研究均提示PI3K/Akt/eNOS信号通路与调控血管内皮功能密切相关。据报道，黄连素可通过激活PI3K/Akt/eNOS通路，改善TNF-α引起的内皮祖细胞受损[20]。本实验中，模型组大鼠胸主动脉的p-PI3K-p85、p-Akt和p-eNOS等蛋白表达低于正常组（P＜0.01），而黄连素组高于模型组（P＜0.01），故推测黄连素可通过激活PI3K/Akt/eNOS信号途径，保护大血管内皮功能。

综上所述，黄连素能保护2型糖尿病大鼠大血管，减轻内皮病变程度，可能与改善糖脂代谢和激活PI3K/Akt/eNOS信号途径有关。本实验仅对此信号途径进行了初步探讨，关于黄连素对糖尿病大血管的保护机制仍需进一步研究，以期为控制和延缓2型糖尿病大血管病变提供理论基础及实验依据。