Notch信号通路在烧伤感染患者淋巴细胞中的表达研究

倪少俊 雷 悦 徐秋月 王 成 刘珑玲

1.遵义医学院第五附属（珠海）医院烧伤整形手外科，广东珠海 519100；2.遵义医学院珠海校区免疫实验室，广东珠海 519090

烧伤患者由于皮肤的完整性受到破坏，其基本功能受到明显损害而失去平衡，使得烧伤患者发生感染的概率有明显且逐渐增加的趋势[1]。在烧伤患者死亡危险因素中，感染是最主要危险因素之一[2]。研究显示，T、B细胞的分化、发育都离不开Notch信号通路的参与[3-5]。烧伤患者机体存在细胞免疫功能低下的同时也会表现出对炎性反应的增强[6-7]，这些病理变化是否有Notch信号通路的参与值得探讨。本课题旨在通过研究Notch信号通路在烧伤感染患者外周血淋巴细胞（peripheral blood lymphocytes，PBL）中的表达，探讨Notch信号通路与烧伤感染患者淋巴细胞的关系，阐明Notch信号在烧伤感染调节中的可能作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院烧伤科2016年7月～2017年7月收治的15例烧伤感染患者作为烧伤感染组，采用中国新九分法估算患者烧伤面积，三度四分法估算患者烧伤深度，其中男8例，女7例；年龄为 21～46岁，平均（36.8±7.90）岁；21岁 2例,32 岁 3 例，37 岁 4 例，40岁1例，44岁2例，46岁3例。选取同期在我院进行健康体检的15例健康者作为对照组，其中男9例，女6例；年龄为 19～52 岁，平均（36.27±10.64）岁；19 岁 1 例，23岁3例，34岁2例，36岁4例，44岁2例，52岁3例。两组的一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会审核批准，入选本研究的对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂

TRIZOL试剂购自美国Invitrogen公司，cDNA合成试剂盒购自德国Qiagen公司，SYBRAdvantageqPCR Premix试剂盒购自日本Takara公司，兔抗人Notch 1和Notch 2抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标本收集及淋巴细胞分离 根据分组结果，分别采取烧伤感染组和健康对照组研究对象的静脉血3～5 ml，肝素抗凝管收集血液样本，人PBL分离液分选获得PBL，操作步骤按试剂说明书进行。收集后的淋巴细胞分成两部分，一部分用于提取总RNA，一部分用于提取总蛋白。

1.3.2 实时荧光定量 PCR（real-time PCR，RT-PCR）检测Notch 1和Notch 2基因mRNA的表达 采用经典的TRIZOL法提取样本细胞的总RNA，取1 μl RNA样品测定A260/A280比值，确保其浓度和纯度符合要求后，其余放在-80℃冰箱中保存备用。cDNA的合成严格按照反转录试剂盒说明书进行操作。采用Takara公司SYBRAdvantageqPCR Premix试剂盒进行PCR反应，总反应体积为20 μl，每个样本做3个重复，取平均值作为最终数值。Notch 1和Notch 2基因及内参β-actin引物序列参照文献[8]，引物由上海生工生物工程有限公司合成，其具体序列见表1。RT-PCR结果采用 2-ΔΔCt方法运算。

表1 Notch1和Notch2基因及内参引物序列

1.3.3 免疫印迹法（Western-blot）检测Notch 1和Notch 2蛋白 裂解PBL提取蛋白，BCA法进行蛋白质定量，根据蛋白浓度计算蛋白及上样缓冲液的体积，总蛋白中加入5×Buffer蛋白上样缓冲液，沸水浴15 min，每个泳道蛋白上样20 μg，行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后恒流湿法转膜，5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h后，加入免抗人Notch 1和Notch 2抗体（稀释比为1∶750）4℃旋转孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5 min。加辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔IgG二抗（稀释比为 1∶1000），孵育 1 h，TBST 洗膜 3次，每次3 min。加入ECL化学发光液，成像仪上进行曝光，对图像进行灰度分析。结果以目的蛋白灰度值与GAPDH蛋白灰度值之比来表示。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用 t检验，以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 烧伤感染患者PBL中Notch 1和Notch 2基因mRNA水平的变化

RT-PCR结果显示，烧伤感染患者PBL中Notch 1和Notch 2基因mRNA表达水平分别是健康人的6.73倍和2.56倍。与健康人相比，烧伤感染患者PBL中Notch 1和Notch 2基因mRNA水平均显著性高于健康人群（P＜0.05）（图 1）。

图1 荧光定量PCR检测

2.2 烧伤感染患者PBL中Notch 1和Notch 2蛋白水平的变化

Western-blot检测烧伤感染患者与健康人群PBL中Notch 1和Notch 2蛋白表达结果显示，健康人与烧伤感染患者的PBL都有Notch 1和Notch 2蛋白表达，并且两者在烧伤感染患者中的表达皆显著高于对照组（P＜0.05）（图 2）。

图2 Western-blot检测

3 讨论

Notch信号通路是一个古老的信号传导途径，在各种低等级和高等级动物中都广泛存在，并且在物种进化过程中保持高度保守性，Notch受体通过与邻近细胞的配体相互作用来精确调节各谱系细胞和组织的分化，是一条影响细胞命运的信号转导通路。完整的Notch信号通路组成包括Notch受体、Notch配体和细胞内效应分子DNA结合蛋白以及Notch的调节分子等[9]。国内外的研究显示，Notch信号在外周免疫系统中发挥重要作用，对免疫细胞分化和调节过程的作用尤为显著[10-11]。特异性抗原激活淋巴细胞后进行特异性的克隆扩增，促使Notch 1受体表达基点上调；同时T细胞亦对相关的细胞因子（如IL-1、IL-4、IL-10等）作出了一系列反应、调节。T细胞在生长过程中由这些细胞因子通过信号传导并且诱导进行定向分化[12]，Notch信号通路又通过一系列途径促进淋巴细胞分化、增殖。Notch信号也可以通过调节淋巴细胞表面CD25的表达以及增强NF-κB的活性，促进干扰素-γ的分泌等途径来促进淋巴细胞的增殖、活化[12-18]，除了 T 细胞，Palaga等[19]的研究显示，Notch 信号也参与巨噬细胞免疫功能的调控。在本研究中，健康人和烧伤感染患者的外周血中都有Notch 1的表达，并且在烧伤感染患者的外周血中表达更高，提示机体在受到感染后通过上调Notch 1的表达来增强免疫系统的功能对抗入侵的病原微生物。

Notch 2作为Notch信号通路的一个重要受体，在机体的外周免疫系统中发挥着复杂的生理病理作用。 秦亚录等[20]的研究显示，Notch 2、3、4-Jagged-1 介导的Notch信号通路激活与外周血炎症因子（IL-1β、IL-8、TNF-α）的高表达与Notch信号通路激活有关。采用基因敲除或者基因沉默方法的研究显示，Notch 2信号可促进Th2分化，Notch 2或Notch 1信号通过促进GATA-3和IL-4的表达来诱导Th2分化。彭思璐等[21]的研究显示，慢性乙型肝炎患者易感染病原菌，且感染后患者血清中Notch 1和Notch 2蛋白水平明显升高，此结果与本课题的研究结果类似。

Notch信号通路对免疫系统的影响还有待进一步研究，笔者从临床角度对Notch信号通路进行了初步的探索，遗憾的是，受条件所限本研究没有得到进一步深入。总而言之，PBL中Notch通路的Notch 1、Notch 2受体的表达与外周免疫系统的诸多生理和病理活动密切相关，通过检测PBL中两个重要Notch受体表达水平的变化，能够为临床医生全面了解烧伤患者的感染程度和判断预后提供有价值的参考，将Notch受体的表达变化作为参考指标以选择合适的治疗方案，具有较高的临床应用价值。如果能将Notch 1和Notch 2受体联合其他多种免疫细胞因子检测，如抗炎因子、促炎因子等，有望进一步增加其敏感度和特异性，提高和拓展其临床诊断与治疗方面的应用。