白英生物碱对人宫颈癌HeLa细胞的抑制作用

丁书军 廖洁 张琛晓 黄丽霞 黄宁 汤旭 余兴火

[摘要]目的 探讨白英生物碱（STA）对人宫颈癌HeLa细胞的抑制作用。方法 提取STA并制备4.0、8.0、16.0 mg/L等3种浓度的STA反应体系，分别定义为反应体系A、B、C，设置空白对照，培养24 h后通过MTT法检测各反应体系光密度（OD）值和对人宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制效果。结果 不同浓度STA反应体系的OD值比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;反应体系C的OD值显著低于空白对照、反应体系A及B，差异均有统计学意义（P<0.05）;反应体系B的OD值显著低于空白对照和反应体系A，差异均有统计学意义（P<0.05）;反应体系A的OD值显著低于空白对照，差异有统计学意义（P<0.05）。不同浓度STA反应体系的细胞生长抑制率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;反应体系C的细胞生长抑制率显著高于反应体系A和B，差异均有统计学意义（P<0.05）;反应体系B的细胞生长抑制率显著高于反应体系A，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 STA对人宫颈癌HeLa细胞增殖有一定的抑制作用。

[关键词]白英生物碱;人宫颈癌HeLa细胞;细胞增殖

[中图分类号] R711.74          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）8（c）-0034-03

[Abstract] Objective To investigate the inhibitory effect of solanumlyratum Thunberg alkaloid （STA） on human cervical cancer HeLa cells. Methods Extraction of STA and preparation of three concentration STA reaction systems 4.0， 8.0， 16.0 mg/L were defined as reaction systems A， B and C， respectively， and the blank control was set. The optical density （OD） value of each reaction system and the inhibitory effect on the proliferation of human cervical cancer HeLa cells were detected by MTT method after 24 hours of culture. Results The OD values of STA reaction systems at different concentrations were significantly different （P<0.05）. The OD value of reaction system C was significantly lower than that of blank control， reaction system A and B， the differences were statistically significant （P<0.05）. OD value of reaction system B was significantly lower than that of blank control and reaction system A， the differences were statistically significant （P<0.05）. OD value of reaction system A was significantly lower than that of blank control， the difference was statistically significant （P<0.05）. The growth inhibition rates of STA reaction system at different concentrations were significantly different （P<0.05）. The growth inhibition rate of reaction system C was significantly higher than that of reaction system A and B， the differences were statistically significant （P<0.05）. The growth inhibition rate of reaction system B was significantly higher than that of reaction system A， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion STA can inhibit the proliferation of human cervical cancer HeLa cells.

[Key words] Solanumlyratum Thunberg alkaloid; Human cervical cancer HeLa cells; Cell proliferation

白英（Solanumlyratum Thunb），又稱之为白毛藤，属于茄科植物，临床上多用于宫颈癌、肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌等多种恶性肿瘤的治疗[1]。流行病学研究调查显示，宫颈癌是妇女最常见的生殖系统恶性肿瘤[2-3]，给患者的身心健康带来严重影响。既往研究认为，白英水提物可通过多种机制对人宫颈癌HeLa细胞株产生抑制作用。韦星等[4]报道，白英水提物对HeLa细胞有较强的增殖抑制和诱导凋亡作用，其分子机制可能涉及caspase-3基因表达上调、survivin基因表达下调等。韦星等[5-6]报道，白英提取液能促进HeLa细胞凋亡，其分子机制可能涉及上调Fas基因、p53蛋白表达及下调FasL基因、Bcl-2蛋白表达等。值得注意的是，白英提取既可以采用无机溶液，也可以采用有机溶液，白英有机溶液提取物对人宫颈癌HeLa细胞株的抑制作用有待临床进一步研究。本研究旨在探讨白英生物碱（Solanumlyratum Thunberg alkaloid，STA）对人宫颈癌HeLa细胞的抑制作用，现报道如下。

1材料与方法

1.1试验材料

江西省妇幼保健院药剂科中药房提供的白英（批号：20160911）;美国典型菌种收藏所（ATCC）提供的人宫颈癌HeLa细胞株（批号：29328），75%乙醇（济南康奥医疗器械有限公司，批号：20171224）;二甲基亚砜（DMSO，南京建成生物工程研究所，批号：302A0334）;胰蛋白酶消化液（南京建成生物工程研究所，批号：20180420）;四甲基偶氮唑蓝（MTT，上海普飞生物技术有限公司，批号：20180527）;胎牛血清（美国Gibco公司，批号：20180711）;RPMI-1640培养基（美国Gibco公司，批号：20180605）。RE-201型旋转蒸发仪（上海科兴仪器有限公司），BIOBASE-EL10A型酶标仪（山东博科生物产业有限公司）。

1.2试验方法

①STA提取：在40℃环境中采用75%乙醇将50 g 白英粗粉浸泡3 h×3次，每次浸泡结束后均收集滤液，将3次的滤液合并在一起采用旋转蒸发仪干燥并得到白英浸膏，DMSO溶解ST浸膏并配制10 g/L STA提取液，采用细胞培养液将上述STA提取液配制成4.0、8.0、16.0 mg/L等3种浓度备用，且分别定义为反应体系A、B、C。②人宫颈癌HeLa细胞株培养：含10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml的RPMI-1640培养基，在5%CO2、37℃培养箱下进行细胞培养，直至细胞铺满瓶底，然后用0.25%胰蛋白酶消化液处理细胞，分瓶后3～5 d传代1次。③细胞增殖抑制试验：取对数生长期的人宫颈癌HeLa细胞株，胰蛋白酶消化液处理后吹打成浓度为1.0×104个/ml的单细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔200 μl，培养24 h，细胞贴壁后吸弃孔内原培养液，分别加入200 μl上述配好的4.0、8.0、16.0 mg/L STA，注意设置空白对照，每一浓度设置6个复孔。培养20 h后，在每孔中加入20 μl浓度为5 mg/ml的MTT液，37℃孵育4 h，吸弃培养液，加入150 μl DMSO，在室温下采用振荡混匀10 min。

1.3观察指标及评价标准

通过MTT法检测各反应体系光密度（OD）值和对人宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制效果。①OD值：在细胞增殖抑制试验过程中，室温振荡混匀，待结晶充分溶解后在492 nm波长处测定，重复3次取平均值。②细胞生长抑制率：采用如下公式进行计算，细胞生长抑制率=（空白对照组OD值-试验组OD值）/空白对照组OD值×100%[7]。

1.4统计学方法

采用统计学软件SPSS 21.0分析数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验;计数资料以率表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同反应体系OD值的比较

不同浓度STA反应体系的OD值比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;反应体系C的OD值显著低于空白对照、反应体系A及B，差异均有统计学意义（P<0.05）;反应体系B的OD值显著低于空白对照和反应体系A，差异均有统计学意义（P<0.05）;反应体系A的OD值显著低于空白对照，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

2.2不同反应体系细胞生长抑制率的比较

不同浓度STA反应体系的细胞生长抑制率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;反应体系C的细胞生长抑制率显著高于反应体系A和B，差异均有统计学意义（P<0.05）;反应体系B的细胞生长抑制率显著高于反应体系A，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

3讨论

宫颈癌是目前临床严重影响妇女健康的最常见恶性肿瘤之一，调查研究显示，我国每年有大约20万妇女死于宫颈癌，其发生率仅次于乳腺癌，位居妇女肿瘤疾患的第2位，且有年轻化的趋势[8-9]。由于宫颈癌恶性程度高，对患者危害巨大，因此探索宫颈癌的防治方案成为当前医学研究的重要课题。在宫颈癌治疗方面，西医主推手术、放射治疗、化疗等方案，且这些方案的治疗效果有目共睹，祖国传统医学亦在宫颈癌患者的治疗过程中发挥着举足轻重的作用[10]。

眾所周知，祖国传统医学应用的药物众多，其中白英药用历史久远，其具有清热利湿、解毒消肿之功，既往在治疗黄疸、水肿、胆结石、胆囊炎、风湿性关节炎等诸多疾病方面取得了较好的治疗效果[11]。随着对白英研究的深入，白英抗肿瘤及治疗相关并发症的效果逐步得到认可。韦星等[12]报道，将中药白英汤实施于晚期非小细胞肺癌患者，其临床效果理想，安全性高。霍焰等[13]报道，加味白英汤防治鼻咽癌三维适型放疗后口腔干燥症的临床疗效确切，可促进患者唾液分泌量的增加，缓解口腔干燥症状。在基础医学研究方面，白英抽提物对各种癌细胞株的拮抗作用亦得到研究。Yu等[14]报道，STA可明显诱导人肺腺癌A549细胞株凋亡，其机制可能与抑制NF-κB/p65信号通路有关。Endeshaw等[15]报道，STA能够抑制Huh-7细胞增殖，诱导Huh-7细胞凋亡，其机制与调控p38和Caspase-3蛋白有关。

既往临床对白英治疗宫颈癌细胞株的基础研究亦有报道，白英水提物可通过多种机制对人宫颈癌HeLa细胞株产生抑制作用，包括上调野生型p53蛋白表达以及下调Bcl-2蛋白表达，上调Fas基因表达以及下调FasL基因表达等。值得注意的是，既往探索白英治疗宫颈癌的基础研究主要采用白英水提物，白英乙醇提取物即STA研究报道较少，而诸多研究认为白英水提物以及STA均有良好的抗肿瘤效果。基于该情况，本研究亦设置3种不同浓度的STA反应体系，同时设置空白对照，采用人宫颈癌HeLa细胞株作为观察对象，结果显示，随着STA反应体系浓度的增加，其OD值逐步下降，人宫颈癌HeLa细胞生长抑制率逐步升高，提示STA对人宫颈癌HeLa细胞增殖有一定的抑制作用。由于本研究的实验条件有限，STA对人宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制机制尚未完全明确，有待进一步研究探索。

[参考文献]

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[11]王剑，李玲香.加味白英汤防治鼻咽癌三维适型放疗后口腔干燥症的疗效分析[J].中国医师杂志，2017，19（5）：750-751.

[12]韦星，李朝敢，李韬，等.白英生物碱通过抑制NF-κB信号通路诱导人肺腺癌A549细胞凋亡[J].中药材，2013，36（5）：787-790.

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[14]Yu Y，Shen HM，Fang DM，et al.LncRNA HCP5 promotes the development of cervical cancer by regulating MACC1 via suppression of microRNA-15a[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2018，22（15）：4812-4819.

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（收稿日期：2019-02-01  本文編辑：刘克明）