KLF6在口腔癌细胞恶性生长中的作用机制的实验研究

刘圆月 侯菊花 李灿

[摘要]目的探讨KLF6在口腔癌细胞恶性生长中的作用机制。方法应用免疫组化法检测95例口腔鳞癌组织和95例正常口腔黏膜组织中KLF6、p21和cyclinD1的表达。结果KLF6、p21，和cyclinD1在口腔鳞癌与正常口腔黏膜组织之间的差异均有统计学意义（P<0.05）；KLF6与p21的表达存在正相关，与cyclinD1表达存在负相关（P<0.05）。结论KLF6基因在口腔鳞癌的发生起着作用，KLF6与组织分化的关系提示浆表达的KLF6可用于判定肿瘤患者预后，而p21和cyclinD1可能是作用的两个靶点。

[关键词]KLF6；口腔癌细胞；作用机制；实验研究

[中图分类号]R78 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721（2012）12（a）-0092-02

在世界范围，口腔鳞状细胞癌（OSCC）为一种常见的口腔癌[1]，尽管医疗技术取得了巨大进步，但口腔癌的预后仍然不够理想。最近研究表明，癌发病的过程包括细胞增殖加速，细胞凋亡减弱，凋亡失败等。KLF6是普遍表达的锌指转录因子，它与生长发育、细胞分化及生长相关的细胞信号转导，细胞增殖、凋亡、血管生成等都有关。本文旨在研究KLF6是否与口腔癌的发生相关，并探究其与p21和cyclinD1蛋白的关系。

1资料与方法

1.1一般资料

从本院2009年12月～2012年4月口腔鳞状细胞癌患者中，随机选95例作研究组，男65例，女30例，年龄37～75岁，平均52.8岁；术前均未经任何放、化疗等治疗；其中，舌39例，口底27例，牙龈9例，颊13例，硬腭7例；临床分期：Ⅰ期39例，Ⅱ期27例，Ⅲ期15例，Ⅳ期14例；颈淋巴结转移者32例，无颈淋巴结转移者63例。取每例标本肿瘤边缘5mm外的癌旁正常口腔黏膜95例（均未见肿瘤组织）为对照，其中，舌39例，口底27例，牙龈9例，颊13例，硬腭7例。

1.2实验方法

1.2.1主要试剂与染色方法 兔抗人cyclinD1单克隆抗体购于福州迈新生物技术有限公司，鼠抗人p21蛋白单克隆抗体，多克隆兔抗KLF6均购自SantaCruz公司。以上病理组织标本均经甲醛溶液固定、石蜡包埋，制成4μm厚切片。进行免疫组织染色，以PBS替代一抗作为阴性对照。

1.2.2结果判断 在高倍镜下对着色反应作如下评分：无着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；阳性范围：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～100%为3分；两项结果相加，0～1分为阴性（-）、2～7分为阳性（+）。

1.3统计学方法

应用SPSS17.0统计软件，计量资料采用t检验，计数资料采用卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1KLF6、p21、cyclinD1在口腔癌组与对照组的表达

KLF6蛋白在细胞核和细胞浆均有呈黄色或棕色表达；p21及cyclinD1蛋白主要在细胞核呈现黄色或棕色表达，cyclinD1在口腔癌组的阳性表达显著高于对照组（P<0.05），而KLF6、p21在对照组的阳性表达高于口腔癌组（P<0.05），见表1。

2.2KLF6，p21，cyclinD1与口腔鳞癌临床病理学关系

KLF6在不同组织分化组差异有统计学意义（P<0.05）；但KLF6在不同年龄、淋巴结转移及临床分期组的差异无统计学意义（P>0.05）；p21在不同组织分化组表达差异有统计学意义（P<0.05）；但p21在不同年龄、临床分期及淋巴结转移组的差异无统计学意义（P>0.05）。cyclinD1在不同淋巴结转移组，临床分期组的差异有统计学意义（P<0.05），而在不同年龄、组织分化组的表达差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

2.3KLF6、p21、cyclinD1三者表达的相关性

KLF6与p21的表达存在正相关，与cyclinD1表达存在负相关（P<0.05），见表3。

3讨论

研究发现大多数肿瘤细胞都存在一些细胞周期调控因子的表达异常，哺乳动物细胞分裂及分化的主要调节事件发生在G1期，G1期周期蛋白异常表达可能导致细胞周期失调，导致肿瘤的发生[2]。

p21属于细胞周期依赖激酶抑制物，主要通过阻止视网膜母细胞瘤（Rb）基因的磷酸化来调节转录因子E2F的活性。当Rb基因处于磷酸化状态时，调节细胞周期进展的一些关键基因的转录不可以被E2F激活。以此，p21阻止了G1期向S期的过渡，将细胞周期阻滞在G1～S期，从而抑制细胞的生长。蔡杨等[3]推测p21基因失活是口腔癌发生过程中的早期分子事件。cyclinD1也被认为是在细胞周期蛋白家族中限制G1期向S期转化中重要的调控因子之一。该基因的扩增、染色体重排或转录后调节都可导致其蛋白的过表达而发生癌变，cyclinD1的N端的序列可与Rb结合，在CDK4的协助下，使Rb蛋白被磷酸化，总之，cyclinD1的基因扩增和过表达可导致高磷酸化的Rb，从而促进G1/S期转化，加速细胞周期，使细胞持续增殖导致恶性转化[4]，因此，p21与cyclinD1均是口腔癌发生的关键蛋白。

有研究[5-6]报道KLF6与前列腺癌、肝癌的发生有密切关系。KLF6主要通过抑制肿瘤细胞的增殖以及促凋亡发生作用，除此外它的表达还与体内一氧化氮的合成相关，可使细胞内源性一氧化氮合酶的mRNA的表达增加3～4倍，TGF-β1和TGF-βⅠ、Ⅱ型受体以及HSP47、诱生型一氧化氮合酶等也是KLF6的靶基因。这些靶点都可以参与机体的细胞周期调控、细胞凋亡等多种生物学行为[7-8]，以上均说明KLF6对肿瘤的抑制功能。本实验结果显示，KLF6与口腔癌相关。口腔癌KLF6的表达高于对照组，且随着细胞分化程度降低，细胞增殖能力增强以及细胞恶性程度增加，异常的KLF6大量增加出现在细胞浆中，提示浆表达的KLF6可作为判定肿瘤恶性程度的指标。有研究发现单核苷酸多态性可增加KLF6基因选择性剪切的发生，产生的变异体如KLF6-SV1及KLF6-SV2等可影响p21的表达，因此在胞质中竞争转录辅助因子或隔离野生型KLF6，以此对抗野生型KLF6对生长的抑制，SirachE等[9]研究发现在肝癌细胞株中，KLF6通过p21阻止Rb基因磷酸化，下调细胞周期蛋白cyclinD1，从而干扰细胞从G1期向S期转化，使肿瘤细胞的生长抑制，本次研究发现的恶性肿瘤中KLF6基因核表达缺失或减弱与p21表达下调呈显著正相关，正常组织KLF6表达cyclinD1表达显著负相关也支持以上结论。因此，笔者推测KLF6的功能是通过上调p21蛋白的表达及对cyclinD1的抑制而发挥作用。总之，KLF6与口腔鳞状细胞癌的发生发展密切相关，p21及cyclinD1可能是KLF6作用的其中两个靶点，具体机制值得进一步深入研究。

[参考文献]

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[9] SirachE，BureauC，PeronJM，etal.KLF6transcriptionfactorprotectshepatocellularcarcinoma-derivedcellsfromapoptosis[J].CellDeathDiffer，2007，14（6）：1202-1210.

（收稿日期：2012-07-13 本文编辑：林利利）