兔骨缺损ESW治疗后成骨细胞中VEGF的表达

王　林　李　平　贾海峰　张国华

[摘要] 目的:观察体外冲击波(ESW)干预兔骨缺损模型后成骨细胞中血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达情况,初步探讨其促进成骨作用的分子生物学机制。方法:将18只中国健康家兔制备双桡骨骨缺损动物模型,右上肢作为实验组,左上肢为对照组,1周后全麻下行右上肢ESW治疗,左上肢不做治疗。定期拍X线片、组织学观察、免疫组化检测。结果:①X线光片显示冲击波治疗4、6周后,治疗组骨愈合较对照组好;②组织学观察显示治疗组骨细胞、成纤维细胞、毛细血管内皮细胞、成骨细胞、间充质细胞等细胞增生活跃;③免疫组化方法示治疗组成骨细胞中VEGF含量明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:ESW干预后成骨细胞中生物学活性因子VEGF表达增加,可能是ESW促进成骨细胞成骨活动的有力证据。

[关键词] ESW;成骨细胞;血管内皮细胞生长因子;骨缺损

[中图分类号] R682.1+7 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721(2009)07(a)-023-02

根据ESW物理特性开展的ESW疗法( ESWT) 已被广泛的用于骨科慢性软组织损伤的非手术治疗。近些年,国内外又有学者将ESWT用于成人早期股骨头缺血性坏死的保守治疗[1-2],但ESW疗法治疗骨骼肌系统疾病的机理仍不清楚。目前有关冲击波干预骨缺损模型后成骨细胞中VEGF表达的文献报道甚少。本研究在制作兔骨缺损模型和测知理想冲击波干预能量的基础上,观察ESW干预后成骨活性因子VEGF的表达,探讨ESW的促成骨作用,为进一步扩展ESW疗法治疗成骨障碍性疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

HB-ESWL-VG型多功能冲击波碎石机,VEGF抗体。

1.2 兔骨缺损模型的制取

参考林博文等[3]兔桡骨骨缺损模型制备方法,选取健康中国家兔18只,用10%水合氯醛液按3 ml/kg体重行耳缘静脉麻醉,拍X线片观察模型制作情况。

1.3 受试对象的分组及干预

每只家兔均以右上肢为实验组,左上肢为对照组。实验组进行ESW治疗,对照组不加干预。

1.4 X线检查

冲击波治疗后,在第4、6周分别行骨缺损X线拍片,观察骨缺损愈合情况。

1.5 组织学检查

分别于冲击波治疗后第4周、6周时各取9只动物处死,均取原骨缺损部位组织进行脱钙、固定、石蜡包埋,HE染色后光镜检查组织情况。

1.6 免疫组化染色

采用SABC免疫组化染色法,观测细胞浆内VEGF的表达。具体步骤依试剂盒说明进行。计算光密度值。

1.7 统计学方法

数据处理应用SPSS13.0统计软件,行光密度值t检验进行统计学分析,检验标准:α=0.05。

2 结果

2.1 X线检查

动物模型制备成功后,X线检查符合标准。桡骨骨缺损约1 cm,两断端边缘整齐。冲击波治疗后第4、6周实验组骨痂形成较对照组明显。4周时实验组骨痂形成多于对照组;6周时实验组骨痂髓腔形成较对照组明显。

2.2 组织学检查结果

2.2.1 冲击波治疗4周时两组组织学表现 实验组:骨外膜大量成骨细胞聚集,呈栅栏状排列,其胞核大,深蓝色,圆形或呈柱状。可见较多的成纤维细胞散在于成骨细胞间。原骨缺损纤维连接处见间充质细胞呈活跃增生,大量排列有序的成纤维细胞。细胞核浓染,细胞处于活跃增生状态;对照组:骨折端仍为纤维组织,表现为一些均质样物质,少量的有形细胞。

2.2.2 冲击波治疗6周时两组组织学表现 实验组:新生骨小梁开始形成,成骨细胞和成纤维细胞成骨,逐渐包埋于骨陷窝内;对照组:新生骨小梁稀疏,仍主要为慢性炎症反应和纤维组织。

2.3 免疫组化检查

实验组:4周时可见较多小血管增生,大量成骨细胞出现细胞浆黄染阳性表现。6周时较少新生小血管增殖,较多血管成骨细胞出现细胞浆黄染阳性表现;对照组:4周和6周时仅少量成骨细胞出现VEGF阳性表达。将4、6周实验组及对照组的免疫组化切片行光密度值分析,并进行两样本t检验,其P<0.05,差异具有统计学意义。提示ESW治疗4周时实验组VEGF表达高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);治疗6周时实验组TGF-β1表达仍高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

近些年国内外学者尝试将ESWT用于早期成人股骨头缺血性坏死的保守治疗,取得了较好的疗效[3]。但对其分子生物学机制仍不清楚,可能与其调节多种活性细胞生长因子有关。Geiger F等[4]报道在骨折、伤口愈合、组织修复、各种肿瘤细胞中都有VEGF的表达,上述产生VEGF的病理生理过程的共同特点是均有新生血管的生成和组织高度血管化。一个较为完善的血管网对于骨形成是非常必要的,它不仅能提供营养和氧气,还能输送成骨前体细胞,分泌成骨细胞所需的生长因子。因此诱导骨折后VEGF的表达对骨折的早期愈合具有重要的意义。目前关于VEGF的研究主要是对肿瘤的影响,而对骨折愈合的作用也引起相关学科的重视,研究发现其和骨形成有着直接的关系[5]。

本实验结果表明冲击波治疗后对照组中VEGF呈弱阳性表达,说明VEGF在正常成骨细胞中作用不大,需要有效的刺激促进其表达,而实验组成骨细胞中VEGF的表达在第4、6周时与对照组比较,阳性表达差异有统计学意义。此外组织学检查发现实验组的血管增生较对照组活跃,由此我们推测ESW可能通过上调VEGF的表达进一步促进血管增生,加速骨折愈合。总之,ESW在促进骨折愈合方面其机制十分复杂,它可以促进VEGF及其他各细胞因子的表达,再通过多种信号转导通路在某种正反馈调节机制下,相互作用、相互影响促进成骨细胞、成纤维细胞等的增殖分化,促进骨折愈合,但具体机制仍需进一步研究。

[参考文献]

[1]邢更彦,白晓东,杜明奎,等.ESW治疗成人股骨头缺血性坏死的疗效观察[J].中华物理医学与康复杂志[J].2003,25:472-474.

[2]Ludwig J,Lauber S,Lauer HJ,et al.High energy extracorporeal shock wave therapy of femoral head necrosis in adults[J].Clin Orthop,2001,387:192-126.

[3]林博文,徐忠世.实验性骨不连模型的制作[J].中山医科大学学报,2002,23(5):331-335.

[4]Geiger F,Bertram H,Berger I.Vascular endothelial growth factor gene-activated matrix(VEGF165-GAM) enhances osteogenesis and angio-genesis in large segmental bone defects[J].Bone Miner Res, 2005,20(11):28-35.

[5]Wang M,Zhang W,Crisostomo P,et al.STAT3 mediates bone marrow mesen-chymal stem cell VEGF production[J]. J Mol Cell Cardiol,2007,42(6):9-15.

(收稿日期:2009-04-27)