人微血管内皮细胞不同浓度的siRNA转染效果的实验观察

●蔡飞 高冬

人微血管内皮细胞不同浓度的siRNA转染效果的实验观察

●蔡飞 高冬

目的：观察不同浓度siRNA对人微血管内皮细胞HMEC-1细胞转染效果的影响，优化HMEC-1细胞的转染方法和siRNA用量。方法：HMEC-1细胞采用相同的细胞量接种处理后，荧光标记的siRNA（FAM-siRNA）随机分为高中低浓度及对照四个组，然后运用Lipofectamine®2000 Reagent转染试剂进行转染，培养48h后荧光显微镜观察转染的效果。结果：中高浓度siRNA转染效果较低浓度组好，且中高浓度转染效果相同。结论：中浓度siRNA更适合HMEC-1细胞的转染。

siRNA；HMEC-1细胞；转染

siRNA是一种小RNA分子(约21-25核苷酸)，由RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶加工而成，它能够激发与之互补的目标mRNA的沉默。转染又是指将外源分子导入真核细胞的技术，随着实验技术的发展RNA干扰技术已被广泛的应用于基因功能、基因治疗、信号转导等方面的研究中[1]。由于不同浓度siRNA对于不同细胞的转染效果表现不一致，而很多实验都是以siRNA参考用量为标准，故为了优化实验方法及siRNA的用量，本实验通过观察不同浓度FAM-siRNA对HMEC-1细胞转染效果的影响，为HMEC-1细胞的相关转染提供一个实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人微血管内皮细胞（human microvascular endothelial cells，HMEC-1）由本实验室培养并保存，胎牛血清（美国Gibco公司），MCDB-131细胞培养基（美国Sigma公司），opti-MEM培养基（美国Gibco公司）倒置荧光显微镜（德国Leica公司），Lipofectamine® 2000 Reagent转染试剂（上海吉玛），FAM标记阴性对照siRNA（上海吉玛）。

1.2 细胞培养与分组

1.2.1 细胞培养

HMEC-1细胞采用MCDB-131培养液（含10ng/mL EGF、1μg/mL氢化可的松，10%FBS）于5%CO2，37℃常规培养。

1.2.2 细胞接种

取对数生长期的细胞，胰酶消化收集，制成单细胞悬液，以3×104个/孔接种于24孔板上，分为4组每组3个副孔，37.5℃，5%CO2培养箱中培养过夜。

1.3 细胞的分组及siRNA转染(以100nm/孔为例)

1.3.1 细胞分组

将种有细胞的24孔板分为4组∶高浓度组（100nm）、中浓度组（50nm）、低浓度组（20nm）、对照组（0nm）。

1.3.2 细胞的转染

次日各孔更换新完全培养基，0.5ml/孔。取FAM标记阴性对照siRNA（FAM-siRNA）100nm+opti培养基50ul，吹打均匀，室温放置5min；取转染试剂（lipo2000）1ul+opti培养基50ul吹打混匀，室温放置5min；将上述二者混匀后制成转染复合液，室温放置20min后，将转染复合液100ul加入细胞中，轻摇混匀，37.5℃，5%CO2培养箱中培养6h后，更换为MCDB-131 培养液，48h后荧光倒置显微镜观察拍照。

2 结果

HMEC-1细胞通过不同浓度FAM-siRNA转染48H后，根据肉眼观察图片的荧光强度及细胞转染数表示其转染的效果。如图1所示高中低浓度与对照组相比都具有明显的差异，中高浓度与低浓度对比同样具有显著差异，而中高浓度相比未见明显差异。提示中高浓度siRNA转染内皮细胞HMEC-1效果更好。

3 讨论

图1 不同浓度siRNA对HMEC-1转染48h效果

RNA干扰技术（RNA interference technlolgy）能够利用双链RNA特异性地降解具有同源序列的mRNA，阻断相应基因的表达。随着RNA干扰技术的不断发展，为肿瘤治疗问题的解决提供可能[2]。而本实验为了优化转染的方法及siRNA 的用量，通过运用不同浓度siRNA对HMEC-1细胞进行转染，发现低浓度siRNA转染后与高中浓度相比较转染细胞的数量相差明显，而中高浓度的siRNA对于HMEC-1细胞的转染效果更好，其中中浓度的siRNA在转染细胞数量及试剂用量上都较为适合，与众多实验的用量一致，这可能是由于高浓度与中浓度转染效果一致，而siRNA的使用量上相差较大，故从节约试剂考虑，大部分实验都是采用中浓度siRNA进行转染。本实验对比了高中低浓度siRNA对内皮细胞HMEC-1进行转染的效果，优化了实验的方法及siRNA的用量，为内皮细胞相关siRNA转染提供一定的参考价值，但是是否适用于所有细胞还需要进一步研究。

（作者单位：福建中医药大学中西医结合学院）

[1]张良鹏，吴小娟，汤绍辉．RNA干扰与肝细胞癌治疗［J］．广东医学,2012,33(6):870-872.

[2]欧阳金生，陈成水，李玉苹，等.SiRNA CD31沉默PECAM-1对鼠源血管内皮瘤细胞VEGF表达的影响[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2014，21（2）：160-164.