实时荧光定量PCR技术在细菌布鲁氏菌检验中的应用效果

谢晓丹

（江门市新会区第二人民医院，广东 江门 529100）

0 引言

布鲁氏菌是起源上世纪的人畜共患病症，布鲁氏菌通常具有羊、牛、猪、犬、绵羊以及沙林鼠等6个种类，其中牛、羊、猪、犬是主要的人畜共患菌种[1]。该病症会促使患者产生生殖器官炎症，造成不孕不育等病症，并且病菌的影响具有隐匿性，通常情况下无法迅速探知细菌的存在[2]。另外，该细菌无有效的药物进行清除，仅通过控制为主。因此早期的诊断对护理措施的开展有重要作用，检测通常可分为血清检测和分子生物监测，本次通过选用PCR技术，即分子生物学检测，为探究实时荧光定量PCR技术在细菌布鲁氏菌检验中的应用效果，选取疑似带有细菌布鲁氏菌患者进行研究，有以下报告。

1 资料与方法

1.1 一般资料

通过选取我院2019年1月至2020年1月的200例疑似带有细菌布鲁氏菌患者进行研究，通过采用实时荧光定量PCR技术减小检测，经过病理检测可知受检测患者包含86例布鲁氏菌患者，17例沙门菌患者，32例金色葡萄球菌患者，43例副溶血性孤菌患者以及22例轮状病毒患者。

1.2 检测方法

相关仪器及试剂：采用定量PCR扩增仪和其他离心机以及细菌基因组提取试剂盒。

方法：常规PCR测试方法，选用50μl，10×buffer5μl，同时引物各取0.25μl，Taq聚合酶0.8μl，dNTPs0.5μl，粗体DNA模板1μl。扩增条件：设定温度为94℃，对样本变性4min，随后以94℃变性45s后降低至58℃变性40s，后延伸至72℃变性60s，共计需要经32次循环过程，最后以72℃保温5min[3]。

实时荧光定量PCR检测：①样本提取：首先采用热裂解法提取10mL的细菌培养液置于试管，随后通过使用蒸馏水对其进行灭菌洗涤，共2次，最后选用1mL的蒸馏水悬浮，隔水煮沸10min，同时以8000r/min的离心操作进行10min离心，取上清制成DNA模板溶液。②PCR反应，于定量扩增仪进行扩增检测，根据说明书对参数进行设定，同时需要对阳性梯度模板和阴性对照。

1.3 观察指标

观察实时荧光定量PCR检测在各个细菌中的特异性和灵敏度。特异性根据PCR试剂盒以及引起病症的细菌类型进行分析，共计5类病菌；灵敏度以定量对照模板进行10倍系列稀释，选取一项浓度检测结果体现在2×102～2×107/mL的范围之间，并体现其灵敏度[5]。

观察PCR常规检测法与实时荧光定量PCR检测的阳性率差别。

1.4 统计学方法

应用统计学软件SPSS 18.0对资料进行分析处理，患者的计量资料（±s）与计数资料（%），分别应用t、χ2检验，以P＜0.05为差异，有统计学意义。

2 结果

2.1 各细菌携带者的特异性和灵敏度情况

实时荧光定量PCR检测在各个细菌中的特异性和灵敏度分别为，特异性：布鲁氏菌100.00%，沙门菌48.64%，金色葡萄球菌72.17%，副溶血性孤菌55.63%，轮状病毒31.69%。灵敏度布鲁氏菌99.9%，沙门菌42.56%，金色葡萄球菌61.52%，副溶血性孤菌51.91%，轮状病毒26.48%，详情见表1。

表1 各细菌携带者的特异性和灵敏度情况[n（%）]

2.2 PCR常规检测法与实时荧光定量PCR检测的阳性率对比

实时荧光定量PCR技术的阳性率为43.00%（86/200），高于常规PCR检测法的30.50%（61/200）。

表2 PCR常规检测法与实时荧光定量PCR检测的阳性率对比[n（%）]

3 讨论

我国属于布鲁氏菌的高发国家，在青海、西藏等地区具有极高的患病率，由于无有效的药物进行治疗，因此对病症的预防具有重要作用。国际医学学者在布鲁氏菌的研究中提供了多项诊断操作，主要包含了以下两大内容：①病原学检测，病原体的分离培养是医学目前诊断病症的黄金标准。也是最有效的细菌检测方式，但由于时间长、危险性高，同时需要培养活菌，操作人员具有感染的风险，因此无法广泛用于检测。②血清学检测，该内容主要包含平板凝聚试验、补体结合试验以及酶联免疫吸附试验。但由于血清学检测特异性不足，敏感度较差以及操作复杂等缺点，未能被广泛推广。目前有更多的分子生物学方法进行布鲁氏菌是检测，其中则包含了PCR的应用，该方式特异性以及敏感度高，可作用于布鲁氏菌的定型试验[6-8]。

本文通过选取200例携带细菌患者进行研究得出结果：在实时荧光定量PCR技术，显示检测带有布鲁氏菌患者86例，特异性100%，灵敏度为99.9%，均高于其他细菌检测；对比各项常规PCR技术的细菌检测，实时荧光定量PCR技术的阳性率为43.00%（86/200），高于常规PCR检测法的30.50%（61/200），由此可见布鲁氏菌在荧光定量PCR的特异性和灵敏度，同时在与常规PCR检测对比中可保持较高的阳性率，具有较高的诊断价值[8-10]。

综上所述，运用实时荧光定量PCR检测细菌布鲁氏菌，具有高特异性、高灵敏度以及高阳性率，诊断价值较高。