丹参DNA提取方法的优化研究

吴慧

（1.山东卫康医学检验有限公司，淄博市精准基因检测关键技术重点实验室，山东 淄博 255000；2.山东省遗传性疾病基因检测技术应用示范中心，山东 济南 250000）

0 引言

目前，提取高质量DNA的方法较多，但没有一种是被国际认可的高质量提取方法[1-2]。本研究以盆栽陕西商洛一年生紫花丹参的叶片为研究对象，对比分析了四种高质量丹参DNA提取方法的效果，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2019年6月至2019年9月，针对丹参DNA提取方法展开了相应研究，选取盆栽陕西商洛一年生紫花丹参的叶片为研究材料。

试剂：（1）SDS缓冲液：Tris-HCl缓冲液、NaCI各有100mmol/L（PH值为8.0），EDTA有50mmol/L（PH值为8.0），浓度为2%的SDS（g/100mL），常规灭菌后，备用。（2）CTAB缓冲液：Tris-HCl缓冲液有100mmol/L（PH值为8.0），NaCI有4mmol/L，EDTA有20mmol/L（PH值为8.0），浓度为2%的CTAB（g/100mL）。（3）l×TE缓 冲 液：Tris-HCl缓冲液有10mmol/L（PH值为8.0），EDTA有1mmol/L（PH值为8.0）。

1.2 方法

SDS法1与SDS法2：取适量新鲜丹参叶片，置入液氮低温中进行研磨，研磨完成后将叶片置入预冷离心管，将600μLSDS缓冲液预热（已预热至65℃），然后给予65℃的水浴（1-2h），水浴期间轻摇数次，充分混匀后加入等体积酚/氯仿，离心分离10min，提取上清液，加入预冷异丙醇，充分混匀后，在-30℃环境下静置10min，在4℃环境下离心3min。祛除上清液，使用浓度为70%的洗涤沉淀，连续2-3次后，自然干燥。SDS法1：加入50μLl×TE缓冲液在室温下溶解。SDS法2：加入3μLLRNAase在37℃环境下保温1h。然后加入等体积酚/氯仿，充分摇匀后，在4℃环境下离心10min。取上清液置入另一试管中，置入等体积氯仿，充分摇匀后，在4℃环境下离心10min。取上清液置入试管中，在试管中加入十分之一NaAc，给予2倍无水乙醇（冷），充分混匀后静置，在4℃环境下离心3min。祛除上清液，使用浓度为70%的洗涤沉淀，连续2-3次后，自然干燥，加入50μLl×TE缓冲液在室温下溶解[3-4]。

CTAB法与改良版CTAB法：将50mg研磨丹参叶片粉置入预冷离心管，在离心管添加600μLCTAB缓冲液（已预热至65℃），然后给予65℃的水浴1h，水浴期间轻摇数次，充分混匀。在4℃环境下离心10min，取上清液置入另一离心管，加入等体积异戊醇，持续轻摇10min，在4℃环境下离心15min。CTAB法：提取上清液置入另一离心管，加入等体积异戊醇，持续轻摇10min，在4℃环境下离心10min，提取上清液置入另一离心管；改良版CTAB法：提取上清液置入另一离心管，添加2μLNAase，给予37℃的水浴，加入等体积异戊醇，持续轻摇10min，在4℃环境下离心1,5min，提取上清液置入另一离心管。在新管中添加3mL十分之一体积的NaAc与等体积异戊醇，充分混匀后在4℃环境下离心5min，祛除上清液，加入浓度为70%的洗涤沉淀，连续2-3次后，自然干燥，加入50μLl×TE缓冲液在室温下溶解[5]。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行分析。

2 结果

2.1 四种DNA提取方法的电泳检测结果比较

电泳图显示，CTAB法与SDS法1均存在DNA主带，均能有效提取丹参核总DNA，但提取质量存在一定差异。其中CTAB法的电泳图有较为明显的弥散，点样孔比较亮，RNA较多，蛋白质污染较多。而SDS法1的电泳图弥散不明显，点样孔的亮度比较低，RNA、蛋白质污染相较于CTAB法更少，且DNA主带亮度更低。由此可见CTAB法的提取质量劣于SDS法1。而SDS法2、改良版CTAB法提取的DNA无明显弥散，点样孔的亮度偏低，意味着两种提取方法均可有效清除RNA、蛋白质污染。但是，SDS法2是一种基于SDS法1的提取方法，依然无法有效祛除酚类氧化物质污染，所以DNA产率偏低。而改良版CTAB法可避免RNAase的负面影响，在有效祛除DNA、蛋白质污染的同时，可简化提取步骤，可提高DNA产率。因此，改良版CTAB法的DNA提取质量大于SDS法2、CTAB法、SDS法1（P＜0.05）。

2.2 四种DNA提取方法的浓度、纯度比较

四种DNA提取方法提取的丹参DNA浓度、纯度存在明显差异（P＜0.05），详情见表1。

表1 四种DNA提取方法的浓度、纯度比较

3 讨论

DNA分子标记是建立在提取高质量DNA的前提下，因此需要有效、快速提取植物中的DNA，提取的DNA质量也直接影响实验结构[6]。高质量DNA必须高纯度、无降解、高分子量、无蛋白污染、无糖类污染、无盐类污染等杂质污染[7]。而AFLP分子标记模板对DNA有更高的要求。主要是因为高质量DNA可进行完全酶切，具有高特异性，高连接效率，高重复性，获得的实验结果相对可靠准确。临床有研究[8-9]指出，相较于SDS法1，SDS法2的提取质量（DNA产率高，污染少）更优。也有研究[4]指出，改良版CTAB法提取丹参叶片DNA的浓度2.345、纯度356与CTAB法的浓度2.118、纯度706存在显著差异。从本研究结果可看出，相较于SDS法2、CTAB法、SDS法1这三种DNA提取方法，改良版CTAB法提取丹参叶片DNA，质量最好。

由上可知，改良版CTAB法可有效提取丹参DNA。