山西省吕梁地区汉族人群血小板特异性抗原遗传多态性研究

闫学莉，高明伟，王志强，李建伟，李星星，李超

（1.山西省吕梁市中心血站，山西 吕梁 033000；2.山西省吕梁市人民医院，山西 吕梁 033000；3.山西省医科大学第二医院，山西 太原 030000）

0 引言

人类血小板特异性抗原（Human Platelet Alloantigens,HPA）是表达在血小板膜糖蛋白（GP）上的抗原表位[1]，是血小板本身固有的抗原，主要分布 在GP Ⅱb，GP Ⅲa，GPIa，GPIbCD109 上[2]，此抗原是由遗传决定的[3]，为常染色体双等位基因共显性遗传[4]。其基因频率在不同种族、不同地域分布各不相同。近年来，随着成分输血的开展，血小板输注多用于防止和治疗血小板减少症或血小板功能缺损病人的输血，输注过程中可能会因为HPA 不相容会引起血小板同种免疫反应，从而产生血小板同种抗体[5]，引起胎儿或新生儿出现一系列输血不良反应。对山西省吕梁市血小板特异性抗原基因多态性研究，为其提供有效指导，减少输血不良反应的发生。本研究评估了山西吕梁地区400 名汉族人HPA 基因多态性分布，弥补了该地区此项研究的空白，探讨了血小板同型输注的可能性，以期对该地区血小板采集和治疗提供指导。

1 对象与方法

1.1 研究对象

山西省吕梁市本地汉族人群，样本为吕梁市中心血站随机血液标本400份，样本储存于EDTA抗凝管中，所有研究对象均无血缘关系和血液制品输注史。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

Applied Biosystems 公司PCR 仪、北京六一生物科技有限公司DYY-6D 电泳仪，美国Syngene 核酸凝胶成像系统。

1.2.2 试剂

试剂盒选择由北京solarbio 提供的全血基因组DNA、Taq 酶等。

1.3 全血基因组提取

使用红细胞裂解液对样本进行处理，处理后的样本利用柱膜法提取基因组DNA，并对提取的DNA 进行质控，DNA 浓度OD260/OD280 在1.8～2.0 时为合格。

1.4 DNA 扩增

利用聚合酶链式反应对样本DNA 进行扩增。反应体系20μL：Buffer 2μL，dNTPs 1.5μL（2.5μM），正反向扩增引物各1μL，Taq DNA 聚合酶0.1μL（5U/μL），ddH2O 13.5μL，DNA 1μL。引物以相关文献为参考，由上海生工生物有限公司合成。HPA 1、2、3、4、5、6、15 扩增条件：①95℃预变性5min；②95℃变性30s，退火温度分别为56.9℃、55.6℃、61.1℃、54.3℃、50℃、58.8℃、49℃，退火30s，72℃延伸90s，30 个循环；③72℃延伸5min；降温至4℃扩增完成。

1.5 核酸电泳及凝胶成像

吸取1μL DNA loading buffer 以及5μL PCR 产物，随后将其混匀+琼脂糖凝胶1.0%电泳，最后再把凝胶放置在凝胶成像仪中成像分析，对其实验结果加以保存。

1.6 数据处理及分析

按照遗传学基因计数方法计算基因频率。

2 实验结果

2.1 HPA 基因分型

具体结果见图1（以其中的1 号标本为例对结果进行展示）。

图1 HPA 分型结果

2.2 HPA 基因型以及基因频率

按照Hardy-Weinberg 定律，分析以上400 例标本群体遗传结构分化、基因频率与概率、与分化，见表1。

表1 HPA 1-6，15 基因频率计算

3 讨论

血小板抗原主要分为两大类：一类是在其他组织或细胞中也存在的抗原，如红细胞的ABO 类抗原和人类组织相容性复合体HLA-I 类抗原；另一类是人类血小板本身特有的抗原，即血小板特异性抗原[6]。自从1959 年第一个人类血小板特异性抗原被鉴定以来，使用人血清免疫性同种抗体鉴定的方法，至今共发现24 种血小板抗原[7]。其中22 个抗原被血小板命名委员会（PNC）正式命名，命名原则以HPA 为字头连接数字。在等位基因组成的遗传统计中，不同基因型相对应的用小写英文字母a 和b 分类，a 代表基因频率大于50%的等位基因，b 代表基因频率小于50%的等位基因，当未发现等位基因时，基因型用w 表示。22 个正式命名的抗原受控于在人类第5、6、17 和22 号染色体上的6 个遗传位置[8]。除HPA14bw基因为缺失三个碱基的整码突变，其余遗传多态性均为错义突变（SNP）[9]。

HPA 等位基因不管整码突变还是错义突变，都会导致所编码的氨基酸的改变，从而引起膜蛋白质构象的变化，产生不同的抗原性。

近年来临床血小板输注治疗在多种出血性疾病中的广泛应用，使得发生血小板同种免疫致敏的概率越来预高[10]。患者如果要进行血小板输注时，针对性的进行血小板HPA 基因型检测，找与其相适应的同型血小板。这样就能够有效的避免因血小板抗原性不合造成的输血不良反应[11]。因此，人类血小板抗原的遗传多态性的研究对于指导临床血小板输血具有极其重要的意义[12]。

本研究通过SSP-PCR 技术对吕梁地区汉族人群HPA1-17 进行多态性研究，结果显示，HPA 1-6，15呈现多态性，而在其他位点中只检出a 基因。此结果与国内各地区对HPA 多态性研究基本一致[13-14]。

综上所述，吕梁地区HPA 基因有其本身的地域特点，此研究将会为吕梁地区血小板输注治疗提供帮助。同时为研发适用于该地区的HPA 基因分型检测试剂盒奠定了基础。