穿孔素及颗粒酶B 与布鲁菌病相关性研究进展

高国栋，其其格

（内蒙古医科大学附属医院，内蒙古 呼和浩特 010030）

1 布鲁菌病的简介

1.1 布鲁菌病在世界各国的疫情

布鲁菌病的别称有弛张热、波状热或者马耳他热，当布鲁氏菌侵入机体时，会引起人畜共患疾病，流行范围广泛，俗称“懒汉病”。因携带有布鲁氏菌病的羊、牛、猪等家畜在接触中将其传染给人类，因此其在生物接触中具有传染性，但目前研究证明发现，布鲁菌病在人与人的接触中不具传染性。临床症状内容复杂，且不易分类，患病后主要为发热、多汗、乏力、骨关节和肌肉酸痛，通常情况下，患者发热可持续15 ～20 d，且反复性强；通过病理学诊断分析，该症对人体的生殖系统影响效果较为直观，一旦未能及时得到有效控制，将促使患者生殖能力损伤甚至丧失；同时将引发不同程度的关节、肌肉疼痛，严重情况下可直接剥夺患者劳动能力，甚至威胁生命[1]。据世界统计资料显示，2018 年中国布鲁氏菌病发病数量为21735 例，2017 年中国布鲁氏菌病发病数为38554 例。而根据中国疾病预防控制中心的资料显示，布鲁菌病的治愈率在近年间虽然得到有效控制，但发病率仍旧处于较高水平[2]。

1.2 布鲁菌病的发病机制

虽然布鲁菌感染的病症机理较为复杂，但其本质上属于传染性疾病，而传染源大多数是病菌，病菌从患者的皮肤或者粘膜侵入身体，随着淋巴液的移动到达淋巴结，进而被吞噬细胞吞噬。因此欲分析其发病机制，需结合患者自身相关免疫功能，布鲁菌病的免疫反应功能包括两种类型，即先天性免疫与适应性免疫，前者通常为非特异性免疫，后者通常为特异性免疫[3]。在形成病灶的过程中，若免疫系统发挥功能，阻断吞噬细胞，则可有效抑制病情，如果不能杀灭吞噬细胞，会促进细胞内的细菌自由生长繁殖，因而形成局部的原发病灶。在分析布鲁菌病的病变过程可以发现，当病菌进入人体后，最先出现的是中性多核粒细胞。基于此，存活的布鲁菌将随淋巴液到达到局部淋巴结，并在相当一段时间内，不会出现明显病变，此阶段相当于潜伏期[4]。随着疾病进展，没有被免疫系统杀灭的病菌被吞噬细胞吞噬，随着血液的流动带到全身各处，在人体的肝、脾等脏器内繁殖，当病菌繁殖到一定的数量之后，会冲破淋巴结的屏障，进而侵入人体的血液循环，在这种情况下就会出现毒血症等相关症状，从而形成具有多发性的病灶。此时，如果吞噬细胞的吞噬能力低于患者病灶释放的细菌时，会出现细菌在细胞外的血液中繁殖并生长，因此出现败血症的症状。需要注意的是，在不同因素的影响下，如果机体遭受破坏，由患者本身释放的内毒素等成分不仅会造成菌血症、败血症等症状，还会发生毒血症[5]。因此临床检测中，对于内毒素的关注程度相对较高，如果患者感染细菌的量比较大，或者缺失免疫功能，机体中的一部分细菌会避开受到免疫功能的影响，故而这些细菌可能会被吞噬细胞吞噬，然后将其带入到其他的组织或者器官中，最终形成新的感染灶，此阶段在临床中被称为多发性病灶阶段。因此，在不同组织病理损伤的影响下，布鲁菌病的临床表现通常呈现着多样化的趋势。

1.3 布鲁菌病的病理分析

根据人体免疫系统的原理可见，先天性免疫系统是抵抗病原菌入侵的第一道防线，其中以巨噬细胞及树突状细胞为主，而适应性免疫主要由Th1免疫为主，其能够有效清除病原体，从而避免病菌进行扩散。相关研究表明，机体在对抗布鲁菌时，主要靠CD4+及CD8+T 淋巴细胞、Th1类细胞因子（IFN-γ TNF-α）及活化的巨噬细胞和树突状细胞[6]。另一方面，布鲁菌建立了很多逃逸固有免疫与适应性免疫应答的机制，因此其传染途径较多，且不易被自愈因子发现，因此布鲁菌病具有极高的发病率，均源自胞内布式小体达到在宿主胞内长期寄生及复制的目的。巨噬细胞及DCs 吞噬布鲁菌的过程中，清除细菌的过程可在数小时完成，而残留的细菌将进入复制小体[7]。可见，布鲁菌病主要以Th1型细胞免疫应答为主，在治疗的过程中，可通过抑制肿瘤坏死因子的分泌而抑制巨噬细胞凋亡，从而有效弱化其抗原提成功能，达到阻断抗原特异性T 细胞的识别效果，形成有利于生存和繁殖的微环境。因此，布鲁菌的侵犯范围可达人体内的每一处器官组织，对胞内环境的适应能力极强，所以可侧面证实。细菌、病原菌分泌的毒素、免疫抑制、变态反应及内分泌紊乱等现象在布病的发病或在维持疾病状态中都发挥着重要的作用[8]。

通过以上揭示的布鲁菌发病机制，在特异性T细胞免疫应答中，此过程由CTL 细胞参与，而穿孔素及颗粒酶B 在CTL 细胞杀伤病原体方面发挥着重要作用。所以穿孔素及颗粒酶B 在布鲁菌病的发生、发展及转归中亦起着不可忽视的作用。

2 穿孔素及颗粒酶的简介

2.1 穿孔素和颗粒酶的一般性质

穿孔素是细胞毒性T 细胞（CTL）和NK 细胞杀伤的主要毒性蛋白（Perforin），又称孔形成蛋白（PFP），在自身免疫、抗病毒免疫以及抗肿瘤免疫中都有重要的调节作用，是重要的免疫调节及免疫效应分子。单纯从生物学方面理解，穿孔素属于淋巴因子，但因淋巴因子的种类繁多，目前临床研究已明确机制的淋巴因子种类较少，因此临床上广泛认定为淋巴因子的有白细胞介素（约有10 余种）、单核-巨噬细胞移动抑制因子（MIF）、白细胞移动抑制因子（LIF）、单核-巨噬细胞趋化因子（MCF）、白细胞趋化因子（LCF）、B 细胞生长因子（BCGF）、B 细胞分化因子（BCDF）、细胞毒性因子、干扰素等。颗粒酶是外源性的丝氨酸蛋白酶，来自细胞毒淋巴细胞（CTLs）和自然杀伤细胞（NK）释放的细胞浆颗粒，颗粒酶进入细胞，在其内容物释放的影响下，将导致细胞凋亡。此类大分子通常在自然杀伤细胞（NK）中表达，它们在CTL 中的表达受几种细胞因子的调节。其中，已知IL-2、IL-12 都能诱导PFP和颗粒酶mRNA 的大量增加[9]。目前可以确定的是，穿孔素与颗粒酶的效果均是Ca2+十分依赖的，因此在不同的临床情况下测定颗粒酶与穿孔素均可作为健康与病态的全新提示。

目前临床研究已经证实，穿孔素是一种细胞毒颗粒，主要寄存在NK 和CTL 细胞浆内，本质上是糖蛋白的一种，功能和结构与C9补体相似，不具特异性识别功能，因穿孔素是天然杀伤细胞与胞毒T 细胞产生，故而天然杀伤细胞属于非特异性免疫范畴，产生穿孔素只是胞毒T 细胞的功能之一；另外，穿孔素可以使人体细胞破裂也可以使细菌破裂，自然不存在特异性。结合其分子内部信息可见，其通常多个二硫键连接，在非还原状态下，分子量为60 ～65 KD；而在还原状态下，分子量为70 KD。因此人体一旦发生病毒感染或出现传染性疾病，机体内有较高的几率出现病毒感染或肿瘤、移植排斥反应，因此穿孔素的表达也会随之提升。国内外众多文献显示，经纯化的穿孔素能够快速促使靶细胞发生溶解，但在细胞膜自我修复能力的影响下，其必须与颗粒酶共同作用方能促成大规模靶细胞的凋亡效果。

目前临床研究已经证实，颗粒酶是一种丝氨酸蛋白酶，广泛分布于活化的CTL 与NK 细胞胞浆中，截至目前为止，临床上已发现人体中的颗粒酶种类共3 类，为颗粒酶A、颗粒酶B 与颗粒酶C，而发现鼠的颗粒酶有7 种，即颗粒酶A、B、C、D、E、F、G（GrA、GrB、GrC、GrD、GrE、GrF、GrG）[10]。人体内的颗粒酶基因分子量存在30kD、32kD、35kD 等形式，且同一蛋白带有不同的辅基，不仅具有门冬氨酸的活性，同时可被Boc-Ala-Ala-Asp-Ch2Cl 抑制。因此，活化后的CTL 在识别靶细胞后，通过颗粒外排的方式，将颗粒酶分泌到细胞间隙，进而对其进行杀伤，在杀伤的同时，CTL 又能够迅速合成颗粒酶，这些新和成的颗粒酶不仅能够直接分泌到细胞外，又可以储存起来，以供杀伤下一个靶细胞[11]。

2.2 颗粒酶和穿孔素的杀伤机制

明确穿孔素与颗粒酶的生物特性后，临床上已将其广泛应用于疾病的检测与分析中，由于二者均存在于前体细胞中，虽然穿孔素的表达水平并不明显，但是穿孔素在激活NK 和CTL 中却发挥着关键的作用，从而实现提升其表达水平的目的。值得注意的是，一旦CTL、NK 细胞充分融合于靶细胞后，经颗粒胞吐反应，效应细胞释放致密的胞浆颗粒。同时内容物入靶细胞和效应细胞的结合位点处，靶细胞将受到十分严重的攻击，甚至丧失细胞功能。通过众多文献资料可见，其反应过程中将释放出大量的大分子物质，而其中尤以PFP 和颗粒酶占较大比例[12]。因此，分离、纯化的PFP 和GrB 与双标记的靶细胞，并联合51Cr 标记靶细胞膜的特性，是有效降低靶细胞损伤有效途径之一；需满足靶细胞DNA 被125I-Udr 标记、单用PFP 引起靶细胞膜受损释放51Cr 等条件，但若出现125I-Udr 释放，则将促使其损伤延续，加剧疾病反应。而唯有确保靶细胞DNA 连接完整，才能有效保障其反应过程的安全性。基于此，可推测出，将GrB 单用并不是导致1Cr 释放的唯一因素，同时也不是导致125I-Udr 释放的必要原因，其需要在同一时间内满足PFP、GrB 两项条件，缺一不可，才能有效检测出51Cr的释放，观察125I-Udr 快速释放的过程。因此，靶细胞受损的先决条件来自于PFP，而正因为PFB 导致了靶细胞损伤，才能保障后续过程中，GrB 对靶DNA 促成断裂干扰。不过虽然单纯的PFP 无法导致细胞凋亡，但是仍会起到溶解细胞膜的作用，常见于细胞渗透性溶解现象。如果二者同时存在，则需要观察在靶细胞浆内是否再次分布，同时明确其余细胞核的距离；如果在细胞核中同时存在二者，就会直接导致细胞凋亡。分析《穿孔素和颗粒酶的研究进展》中的内容可见，GrB 一旦进入靶细胞，通过目前尚未知的中介物激活P 34 cdc2，可引起染色体浓缩，DNase激活，DNA被切割，最后发生细胞凋亡（Apoptosis）。其在临床研究中，通常将其定义为PFP 间接杀伤功能[13]。

3 穿孔素及颗粒酶与布鲁菌病发病的关系

通过布鲁氏菌效应蛋白及其互作靶标筛选鉴定，解读胞内转运、致病作用、免疫逃逸或持续性感染机制发现，布鲁菌病患者的免疫抑制过程中，CD4+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞、Th1类细胞因子（IFN-γ、TNF-α）及活化的巨噬细胞和树突状细胞占据着主要位置。而统计众多研究文献资料可见，CD8+CTL 具有良好的保护效果[14]。活化的CTL 细胞可以通过Fas 途径，在细胞毒作用和IFN-γ 分泌过程中，激活自身免疫功能，从而抑制布鲁氏菌。经临床资料显示，慢性化及复发患者的外周血CTLs 细胞数量可见其明显高于其他类型的患者，从侧面即可证实，由于慢性期患者的CD4+T 淋巴细胞存在明显的功能缺陷，因此导致患者的病情迁延不愈，反复发作。同时，慢性期患者CD4+T 淋巴细胞上的CD152（CTLA-4）表达上调，能够反映出CD4+T淋巴细胞的损害。基于现有研究的相关数据，CD4+T 淋巴细胞数量起到了决定性作用，如果其水平降低，将导致布鲁菌重要免疫反应的增强，从而促使已失去活性的免疫细胞重新工作，并不断刺激新的免疫细胞诞生，正因如此，在患者疾病发作的过程中，部分患者会从急性期感染症状自然过渡至慢性期感染，在一定程度上，属于典型的免疫抑制效果[15-16]。

综上所述，在布鲁菌病患者的病变感染过程中，在证实外周血白细胞被激活，而细胞毒性淋巴细胞（CTL）接触靶细胞后的情况下，可充分利用穿孔素与颗粒酶生物特性，促使其进入细胞间隙中，在Ca2+的存在下迅速附着于靶细胞膜中，并在其中开拓不同孔道的跨膜通路，完全作用于双层磷脂中，进而促使颗粒酶A、B 等能够完全进入细胞浆与细胞核中，对病毒细胞的DNA 产生阻断效果，从而促成布鲁氏病菌凋亡。

4 展望

布鲁氏菌属内种型繁多，各种型间毒力强度、生物型性状、宿主倾向性、流行特征等方面各不相同。虽然关于此病的研究已有较长的时间，但是在该病的相关领域仍存在较多的问题，而且关于此病的治疗方面，结果仍不理想，因此，在临床中需要进一步明确布鲁菌病的发病机制，充分利用穿孔素与颗粒酶的生物特性，加强二者在布鲁氏菌的分型和病原学检测中的应用，深入研究布鲁氏菌的流行病学特征，继而提升对布鲁氏菌病的治疗效果，以期为布鲁菌病患者带来更多福音。