核酸适配体在生物传感器中的应用研究进展

林冬冬，程东庆（通信作者）

（浙江中医药大学 浙江 杭州 310053）

核酸适配体又称适配体，在1990 年被首次提出，它是通过指数富集配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX）筛选得到的一段DNA 或RNA 寡核苷酸单链，通过分子内碱基配对、静电作用、氢键、范德华力等作用折叠形成多种空间结构，能识别并结合重金属离子、抗生素、小分子等靶分子，具有与抗原-抗体反应相类似的高度亲和性和特异性，被人们称为“化学抗体”。与抗体相比，核酸适配体还具有分子量小（5 ～15 KD）、靶标范围广、免疫原性低、稳定性好、可人工合成、易修饰、应用范围广等特点。生物传感器是一种以生物元件为基础的分析装置，能将定量或定性的生化反应信息转化为电信号或光学信号，具有选择性好、灵敏度高、可在线连续监测等特点。近年来，国内外研究者以核酸适配体作为识别分子与多种传感器相结合，开发了一系列适配体传感器，包括荧光适配体传感器、电化学适配体传感器以及基于纳米材料的各类传统适配体传感器，能够将各种不同信号进行转化，从而达到检测靶标物质的目的，这些适配体传感器在农药、重金属、病原微生物、抗生素检测等领域应用广泛。目前，适配体传感器作为高效、快速、灵敏的检测技术受到广泛关注，其被认为是极具发展潜力的分析工具。本文就荧光适配体传感器、电化学适配体传感器以及基于纳米材料的适配体传感器在上述领域的应用研究进展进行如下综述。

1.荧光适配体传感器

荧光适配体传感器通过适配体与靶物质结合后荧光值的变化对靶物质进行定量检测，由于天然存在荧光的生物分子在自然界中较少见，通常需要对适配体进行荧光标记，产生可测的荧光信号，从而实现对目标分子的检测。荧光标记所依赖的化合物称为荧光物质，它是指具有共轭双键结构的化合物，当受到光照射时，可跃迁成为激发态，而当从激发态恢复到基态时，可释放能量发出荧光。通过荧光标记技术将荧光物质共价结合或物理吸附到所研究分子的某个基团上，利用荧光物质的荧光特性从而对靶物质进行检测。由于SYBR Green Ⅰ具有灵敏度高、热稳定性好等优点，是分子检测中应用最多的DNA 荧光嵌入染料。荧光适配体传感器具有检测快速、操作简单、灵敏性高、稳定性好和特异性强等优点，现被应用于多个领域中对靶物质进行检测。Yang 等建立了一种适配体-SYBR Ⅰ荧光探针传感体系用于检测牛奶中的四环素，在最佳条件下，检出限达1×10mg/mL。

虽然荧光适配体具有高效、快速、灵敏的检测特点，但是荧光背景和荧光寿命都会影响检测的准确性。考虑到荧光标记适配体价格相对昂贵以及荧光团标记易影响适配体与靶物质之间的亲和力，国内外学者就非荧光标记适配体传感器进行了广泛研究。Chen 等以G-四联体结构DNA 替换三联体DNA 结构构建了无标记型荧光适配体传感器，寡核苷酸通过与硫黄素T（Thioflavine T,ThT）结合形成信号转导探针（Signal transduction probe,STP）。基于三螺旋分子开关（Triplehelix molecular switch, THMS），当四环素存在于人血清中时，四环素与适配体结合形成适配体-四环素复合物，具有分解THMS 并释放STP 的功能。游离的STP 组成G-四联体与ThT 结合，产生较强的荧光，检出限低至9.7×10mol/L。Chen 等基于DNA 四臂连接及SYBR Green Ⅰ染料，建立了一种新型的无标记荧光适配体传感器用于牛奶和蜂蜜中氯霉素（chloroamphenicol, CAP）的检测。在CAP 不存在时，CAP 适配体与其互补链进行杂交，形成双链引物/适配体复合物。当CAP 存在时，适配体与CAP 进行特异性识别、结合，从而生成DNA 四臂连接。由于SYBR Green Ⅰ存在于富含碱基对的DNA 四臂的连接处，因此荧光强度增加。在最佳条件下，CAP 的检出限为7.2×10mg/mL。Wei 等以黄连素（berberine,Ber）作为荧光探针，通过Ag+与富含胞嘧啶的适配体特异性结合，建立了一种基于核酸外切酶辅助荧光背景还原的无标记荧光适配体传感器，用于检测自来水和人血清中的Ag，检出限达4.4×10fM。该方法不仅减少了背景干扰并且加强了靶物质的相对荧光强度。适配体芯片是一种新型生物芯片，能够固定不同的基团，根据探针与靶基因碱基互补结合实现基因表达的高通量分析。通过将花青素-3（Cyanidin-3, Cy3）、花青素-5（Cyanidin-5,Cy5）等荧光基团标记在靶物质上，荧光基团标记的靶物质与适配体结合后形成复合物，荧光扫描仪发射光源激发荧光基团产生荧光信号进而检测适配体与靶物质的结合情况，应用荧光对适配体响应信号进行检测。然而荧光基团会破坏靶物质的构象甚至掩盖结果，因此，研究者们正在探索新的非荧光标记的适配体传感器。

2.电化学适配体传感器

电化学生物传感器由生物识别元件和信号转换元件组成，能够将生物分子和靶分子的结合过程转化为可测量的电信号，从而实现对靶物质的检测分析。常用的生物识别元件包括抗体、酶和核酸探针，而核酸适配体以其易于修饰、易于保存、稳定性强等特点，已成为目前研究最广的生物识别元件之一，并与电化学生物传感器合用，形成电化学适配体传感器。近年来，电化学适配体传感器是适配体传感器中研究最广、发展最快的一类。

Nie 等开发了一种基于核酸酶信号循环放大的高亲和力截短型电化学适配体传感器，对牛奶和水样中的妥布霉素进行特异性检测，检测限达5.13×10mol/L。2021 年，Taghdisi 等以双标记适配体作为检测元件，亚甲蓝为氧化还原剂，开发了一种新型电化学检测方法，以亚甲蓝电信号变化来检测人血清、牛奶、自来水中环丙沙星的含量，在最佳测试条件下，环丙沙星的检出限达1×10mol/L。此外，新型电化学检测器件具有提高灵敏度的作用。Zhang 等基于微型集成电路芯片，开发了一种针对4 种高毒性有机磷农药（丙溴磷、水胺硫磷、氧乐果和甲拌磷）的广谱适配传感器，无需额外预处理即可测定水溶液中的目标分子，且具有良好的特异性，检测限达（0.24 ～1.67）fM。电化学适配体传感器具有检测速度快、特异性强、灵敏度高、成本较低、便于携带等特点，是一个极具发展能力的分析工具，但其检测结果易受实验条件和周围环境的干扰，对于标本预处理十分必要。因此，如何更快更有效的降低电化学适配体传感器所受干扰，将其应用于更多领域，有待深入研究。

3.基于纳米材料的适配体传感器

随着纳米技术的发展，基于纳米材料的适配体传感器也得到不断发展。纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围内（1 ～100 nm）或其作为基本单元构成的材料。由于纳米材料结构特殊、尺寸小，因而具有小尺寸效应、量子效应、表面效应、高反应活性等。近年来，量子点、碳点、金纳米颗粒（gold nanoparticles,AuNPs）、银纳米颗粒（silver nanoparticles, AgNPs）等纳米材料被应用到比色、荧光、电化学适配体传感器中，基于纳米材料的适配体传感器极大提高了对目标分子检测的特异性、灵敏度以及准确性。

3.1 基于纳米材料的比色适配体传感器

比色法具有可用肉眼直接观察、无需复杂仪器设备和易于实现即时检测等特点，将比色法与适配体传感器结合形成比色适配体传感器。比色适配体传感器是一种将目标信号转化为颜色变化，用于检测靶物质的适配体传感器，具有实验结果易于观察、实验操作简单等优点。目前，常用的比色法主要是AuNPs、AgNPs 等纳米材料聚集或分散引起的颜色变化来对结果进行直观判定。Abnous 等将适体互补链和双链脱氧核糖核酸结构组成发夹结构组装在AuNPs 上，当人血清样品中存在马拉硫磷时，互补链的发夹结构被释放，颜色由红色变为蓝色，最低检出限为1×10mol/L。基于AuNPs 的比色法应用较为普遍，但研究表明，AgNPs 的消光系数大于AuNPs，能够检测较低浓度的特定DNA 序列，具有更高的灵敏度和可见度。Bala 等使用适配体、阳离子肽和AgNPs 对水和食品样品中的马拉硫磷进行检测，阳离子肽通过静电相互作用将带负电荷的AgNPs 聚集，颜色由黄色变为橙色。该方法具有优异的选择性并且最低检出限低至0.5×10mol/L。考虑到一种物质上可能存在多种农药，Liu 等建立了基于广谱适配体的有机磷农药残留比色检测方法，对不同类型的有机磷农药进行初步筛查，并解决了高通量检测农药残留的问题。此外，Yang 等采用捕获-选择电极法（Capture-SELEX）筛选出与1-氯氟氰菊酯农药结合的适体LCT-1，l-氯氟氰菊酯可截短适体LCT-1 序列获得LCT-1-39，该团队利用LCT-1 和LCT-1-39 作为识别分子，首次建立了检测l-氯氟氰菊酯的比色适体传感器，最低检测限分别为0.019 7 mg/mL 和0.018 6 mg/mL。Sun 等以适体共轭磁性纳米颗粒为探针，基于G-四联体脱氧核酶建立了比色适配体传感器。当鲑鱼样本中存在副溶血弧菌时，适配体与副溶血弧菌结合，其互补链与氯高铁血红素构成G-四联体，导致溶液中的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺和过氧化氢被催化为蓝色，进而检测副溶血弧菌含量。Tao Z 等将石墨烯/FeO-AuNPs 作为酶模拟物，Pb的适配体修饰于胺磁珠表面。当自来水中存在Pb时，通过磁分离将适配体-Pb复合物去除，适配体的互补链吸附于石墨烯/FeO-AuNPs 复合材料表面，抑制催化活性与显色反应，Pb的浓度与溶液颜色成反比，最低检出限达6.3×10mg/mL。2021 年，Liu 等将适配体嵌于亚稳态发夹DNA 结构中，当卡那霉素存在时，铂纳米颗粒催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-HO产生比色反应，进一步提高了比色法检测的灵敏度，牛奶中卡那霉素的检出限低至0.2×10mg/mL。基于纳米材料的比色适配体传感器具有快速筛查的优势，而基于模拟酶或各种酶催化显色反应的比色适配体传感器，不仅可直接肉眼查看检测结果还能提高检测的灵敏度，因此将其与基于纳米材料的比色适配体传感器进行结合应用是目前的研究方向。

3.2 基于纳米材料的荧光适配体传感器

近年来，基于纳米材料的荧光适配体传感器得到了快速发展。YI 等建立了适配体-纳米金-SYBR GreenⅠ荧光探针体系，基于荧光嵌入剂SYBR Green Ⅰ对的自来水、河水和人工尿液中氧氟沙星（ofloxacin, OFL）的残留进行检测，SYBR Green Ⅰ是一种选择性嵌入染料，能与DNA 结合并增强荧光值。如果OFL 存在时，OFL 将与其适体结合形成稳定的复合物，导致OFL 适体结构改变，SYBR Green Ⅰ从OFL 适体释放到溶液中，进而使SYBR Green Ⅰ的荧光值下降。荧光强度在1.1 ～200.0 nm 的氧氟沙星浓度范围内呈线性下降，检出限达0.34 nmol/L。Saberi 等以西曲溴铵为原料，通过水热法合成具有蓝色荧光的阳离子碳点。当（加标）废水、自来水和番茄中存在啶虫脒时，适配体由于静电吸附于碳点表面并与啶虫脒结合，荧光强度随啶虫脒浓度成比例增加。该传感器具有较高的灵敏度，检出限达0.3×10mol/L。随着我国的环保意识不断加强，非标记型荧光适配体传感器也在不断发展。Fan 等以富含AT 的双链DNA 模板与铜纳米颗粒结合作为荧光探针，建立了一种用于啶虫脒检测的无标记、无酶荧光适配体传感器。当苹果和生姜样品中存在啶虫脒时，适配体可与啶虫脒形成靶适配体复合物并与另一条链杂交形成富含AT 的dsDNA（AT-rich dsDNA）。当AT-rich dsDNA 与Cu和抗坏血酸相互作用时产生强烈荧光，该方法的检出限低至2.37×10mol/L。值得一提的是，Zhu 等基于氧化石墨烯的信息计算、编码、加密等系统构建了一个荧光适配体传感器，用于检测鱼类病原体嗜水气单胞菌和迟缓爱德华菌。以氧化石墨烯作为锁，靶标病原体作为公共密钥，适配体与病原菌结合作为加密密钥，进而对适配体进行编码或解码，拓宽了分子水平上多功能器件或机器的发展。2021 年，Wang 等基于适配体与金属有机框架制备了一种分子印迹传感器，将病毒适配体修饰于识别载体表面，并通过硅酸四乙酯自聚合进行表面印迹，检测限低至1.8×10mol/L。该方法以双重识别和比率荧光测定来降低环境干扰，提高传感器的抗干扰能力，进一步推动了分子印迹技术在生物传感器中的应用。基于纳米材料的荧光适配体传感器与比色适配体传感器在检测特点上相似，虽能进行快速、灵敏的测定，但易受检测体系中共存物的干扰，影响测定结果的可靠性，因此降低环境对检测的干扰，将分子印迹技术应用于生物传感器以及将多功能器件或机器与基于纳米材料荧光适配体传感器结合应用还需进一步研究。

3.3 基于纳米材料的电化学适配体传感器

基于纳米材料的电化学适配体传感器具有易于操作、灵敏度高、易微型化等特点，目前也广泛应用于各个领域。Wang 等基于磁性纳米颗粒对牛奶中大肠杆菌O157:H7进行检测，通过尿素酶使阻抗信号的放大并用印刷电路板金电极进行测量，用适配体和尿素酶修饰AuNPs 并注入捕获免疫多克隆抗体的毛细管中与大肠杆菌O157:H7进行结合形成MNP-抗体-细菌-适体-GNP-脲酶复合物，催化毛细管中尿素水解，根据镀金印刷电路板电极检测大肠杆菌O157:H7。Roushani 等基于AgNPs/3-氨基甲基吡啶功能化氧化石墨烯/玻碳电极构建了适配体分子印迹传感膜，通过适配体与CAP 结合形成的氧化电流信号变化，对牛奶中的CAP 进行检测且检出限达3×10mol/L。Xie 等开发了一种基于AuNPs/铂纳米颗粒-碳纳米纤维/碳离子液体电极复合材料的电化学适配体传感器，用于检测饮用水中Hg的浓度，检测限为3.33×10mol/L。YI 等基于三维纳米多孔电极制备了一种新型无标记电化学适配传感器，用于检测茶叶中啶虫脒残留，检出限达71.2 fM。电化学适配体传感器在完成检测后，目标分子容易使电极表面发生钝化现象，影响二次使用。为了解决这一问题，Fu 等基于疏水电极和磁性纳米复合材料开发了一种可刷新电化学适配体传感器，合成的氧化石墨烯-四氧化三铁磁性纳米复合材料与适配体结合可定性检测蔬菜中有机磷农药。由聚二甲基硅氧烷修饰丝网印刷碳电极而制成的疏水电极可避免分子吸附于电极表面，实现电极的重复使用。基于纳米材料的电化学适配体传感器可实现高灵敏度、强选择性的检测，但其稳定性还有待进一步提高。

4.小结与展望

荧光适配体传感器和比色适配体传感器易受到检测体系中共存物的干扰，电化学适配体传感器也易受环境干扰。但由于适配体传感器的应用对我们的健康、环境、食品等领域带来巨大保障，因此非荧光标记适配体传感器与芯片相结合的应用以及降低环境对检测干扰的方法将会成为未来的研究热点。此外，基于模拟酶或各种酶催化显色反应的比色适配体传感器与纳米材料结合应用，不仅可直接肉眼查看检测结果，还能提高检测的灵敏度。目前，基于纳米材料的适配体传感器研究较为广泛，对检测选择性、灵敏度带来一定提升，但仍存在检测稳定性不高、易受干扰等不足。基于纳米材料的适配体传感器具有巨大潜力，是未来发展的重要方向。