微滤膜分离技术在疾控中心微生物检验中的应用价值分析

包 蕾，马惘卿，朱学存，陈 娟（通讯作者）

（云南省玉溪市疾病预防控制中心 云南 玉溪 653100）

微生物检验是疾控中心日常工作中极其重要的一部分内容，在传统的微生物检验中，平板培养检验法常用，但是此种检验方式耗时比较长，灵敏度较低，尤其对微生物的检出率比较低，导致检验效果达不到预期。近年来，随着我国微生物检验技术的不断发展，微生物检验设备的不断升级，微滤膜分离技术逐渐取代了传统的平板培养检验法[1]。微滤膜分离技术中的微滤膜是一种多孔薄膜，此种材料目前已经被广泛的应用在了多个领域，比如食品检验、污水处理、工业废水处理、环境卫生监测等领域，在医疗卫生领域中的运用效果受到了患者及医务工作者的高度认可。本次研究随机选取了在我疾控中心进行待检的40份微生物样本，通过比较不同的检验方式得到的检验结果，详细的分析了微滤膜分离技术的应用优势。现报道如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

2018年5月—2020年12月，从我疾控中心接收的食品微生物待检样本中随机选取40份生禽肉样本作为研究对象。纳入标准：（1）均来自于工作中；（2）样本合格。排除标准：（1）样本质量不合格。根据检验方式的不同，将40份生禽肉样本为观察组和对照组，对照组实施常规平板培养、观察组实施微滤膜分离技术平板培养，每组有样本20份。两组标本一般信息差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

对照组实施常规平板培养检验。检验人员取分割禽肉适量放入无菌自封袋中，加入缓冲蛋白胨水（以每1 kg样品加入500 mL缓冲蛋白胨水的比例）,以100 r/min的速度震荡15 min，无菌操作取出肉块，漂洗液作为原液进行检测。吸取3 mL于100 mL Bolton肉汤中，微需氧条件下，（36±1）℃进行增菌培养24～48 h。将24 h增菌液、48 h增菌液及对应的1:50稀释液分别划线接种于Skirrow血琼脂与哥伦比亚血琼脂平板上，微需氧条件下42±1 ℃培养24～48 h。观察24 h培养与48 h培养的琼脂平板上的菌落形态，Skirrow血琼脂平板上的第一型可疑菌落为灰色、扁平、湿润有光泽，呈沿接种线向外扩散的倾向；第二型可疑菌落常呈分散凸起的单个菌落，边缘整齐、发亮为可疑菌落。挑取5个（如少于5个则全部挑取）或更多的可疑菌落接种到哥伦比亚血琼脂平板上，微需氧条件下42±1 ℃培养24～48 h。取纯培养细菌做氧化酶试验、过氧化氢酶试验、马尿酸盐水解试验和呵哚乙酸酯水解试验（仪器：梅里埃VITEK Compact 30全自动微生物生化鉴定仪）四个生化试验进行初步鉴定。经生化试验初步鉴定为空肠弯曲菌的细菌，需送上级部门进行PCR鉴定复核。

观察组微滤膜分离技术检验。检验人员采用微滤膜作为检验载体，首先取分割禽肉一块（25 g以上）放入无菌自封袋中，加入BPW培养液将样本充分的淹没，置于振荡器上震荡15 min（100 r/min），在无菌的环境下取出肉块，将漂洗液用于后续检测。取2 mL的漂洗液加入到4 mL弯曲菌增菌培养液中，充分混匀，置于微需氧环境下（5% O2、10% CO2和85% N2），不同培养温度增菌24 h用于检测。选择带滤膜的Karmali培养基和哥伦比亚血琼脂（生产企业：青岛中创生物科技有限公司），在无菌的环境下，将滤膜轻轻贴在平板的中央表面，将有网格的一面向上，贴的时候不能产生气泡，取250 μL样板悬液分成5～7点滴在滤膜上，置于37 ℃的环境下搁置1 h，取掉滤膜，在37 ℃的环境下培养48 h。对菌落形态进行测定时，初次分离培养2～3 d，如果菌落不溶血，呈现为扁平、湿润、有光泽、边缘完整、颜色发亮，培养5～6 d后菌落体积增大、颜色灰白、呈现为扁平形态，但是菌落不溶血。取双孔板滤膜印迹内3～4个疑似菌落，进行涂板于接种哥伦比亚血琼脂平板上（无须划线培养，直接挑取单菌落），置于需氧环境中纯化培养24～48 h。取纯培养细菌做氧化酶试验、过氧化氢酶试验、马尿酸盐水解试验和呵哚乙酸酯水解试验（仪器：梅里埃VITEK Compact30全自动微生物生化鉴定仪）4个生化试验进行初步鉴定。经生化试验初步鉴定为空肠弯曲菌的细菌，需送上级部门进行PCR鉴定复核。

1.3 观察指标

统计两组空肠弯曲菌检出率，计算样本检测中受到杂菌干扰的污染率，在两组结果进行统计学比较。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理。正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料用频数和百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

观察组微生物检出率高于对照组（P＞0.05），样本杂菌污染率低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组检验结果比较[n（%）]

3.讨论

微滤膜分离技术是近年来被广泛应用于临床微生物检验中的一种新型检验技术[2]。采用此种技术对标本中的微生物进行检验时，可以将通过物质之间的静压，将其作为一种推动力，如果物质的直径比滤膜孔径大，则可以充分的采用微滤膜分离技术通过半透膜分析法对这些直径比较大的物质进行相应的截留，进一步有效的清除这些气相和液相物质中所存在的一些固体物质还有微生物和一些胶体物质，实现气相物质中、液相物质的净化，达到有效分离微生物的检验目标[3]。经过上述分析后发现，采用微滤膜分离技术进行微生物检验的过程中，微滤膜发挥着极其重要的作用，一般情况下，所采用的微滤膜实际上是一种薄膜，其厚度较薄的为100 μm，较厚的为150 μm，不管微滤膜的厚度属于哪种，其结构上都会均匀的分布多个小孔，这些小孔的作用就是要对粒径在0.02～10 μm的微生物、气相物质中的固体物质、液相中的固体物质等进行过滤[4]。

目前，被广泛应用于实验室中的微滤膜主要为有机微滤膜和无机微滤膜两种，有纤维素酯类、聚丙烯等材料制成的微滤膜属于有机微滤膜，而由玻璃、沸石、金属等氧化物材料所制成的微滤膜则属于无机微滤膜[5]。随着研究的逐步深入，有越来越多的研究人员发现，对样本中的微生物成份进行检验时，与传统的平板分离技术相比较而言，微滤膜分离技术对微生物的阳性检出率以及检测的灵敏度更高，并且在检测时间上更短，在很大程度上避免了样本在培养期间受到其他因素的影响而发生交叉污染的概率[6]。除此之外，微滤膜分离技术对待检样本的要求比较低，只要求待检样本可溶解就可进行检验，并且还能够根据具体的情况，当待检样本能够进行过滤就可进行检测[7]。

本文结果显示，在微生物检出率方面，观察组高于对照组，差异无统计学意义（P＞0.05），进一步提示，采用微滤膜分离技术进行微生物检测，对微生物的检测阳性率更高，应用价值更高。本文结果还显示，在样本污染率方面，观察组低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），与牟玉[8]结果一致，进一步提示微滤膜分离技术实施微生物检验的过程中，样本受到污染的概率更低，检验准确率得到了保障。

综上所述，疾控中心检验人员实施微生物检验时，采用微滤膜分离技术，微生物检出率更高，样本受到杂菌污染的风险较低，可将其在更多的食品检测上应用。但本次观察例数较少，还需今后加大样本量进一步继续观察。