MMCA 技术分析广西苗族妇女叶酸代谢通路关键酶基因MTHFR 677C>T、1298A>C 和MTRR 66A>G 的多态性

杨芳华 王捷 韦笑宝 石美莲 罗世强 钟鑫 严提珍（通讯作者）

（1 柳州市妇幼保健院妇女康复科 广西 柳州 545001）

（2 融水苗族自治县妇幼保健院 广西 柳州 545300）

（3 柳州市妇幼保健院医学遗传科，柳州市出生缺陷预防与控制重点实验室 广西 柳州 545001）

出生缺陷严重危害人类的健康，其预防工作非常重要。叶酸代谢过程中亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因677C>T、1298A>C 和甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）的基因66A>G 多态性与出生缺陷发生有密切关系[1]。叶酸多态性位点的分布存在地区和种族差异性。MTHFR 和MTRR 基因单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）的分型方法主要包括限制性片段长度多态性技术、Taqman-MGB 技术、焦磷酸测序技术等。多色探针熔解曲线法（multicolor melting curve analysis，MMCA）是近几年来新建立的基因分型技术[2]，该技术已广泛应用于单基因遗传病基因突变检测和多发疾病易感SNP 分型[3]。本研究以广西苗族女性为研究对象，采用MMCA 法对 MTHFR 677C>T、1298A>C 和MTRR 66A>G 多态性位点进行基因分型，并与其它地区不同民族的遗传分布特征进行比较。

1.对象与方法

1.1 对象

2019 年1 月—12 月在融水妇幼保健院进行婚育检查的苗族妇女500 例，平均年龄23.05±5.82 岁。本研究经柳州市妇幼保健院伦理委员会批准并征得被检对象知情同意。采集口腔黏膜细胞应用MMCA 法进行检测。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取和浓度测定

严格按照说明书采用柱式提取试剂盒提取样本口腔黏膜细胞DNA，并检测其质量和浓度（ND-1000-UV-VIS 紫外/可见光扫描分光光度计）。

1.2.2 MMCA 法进行MTRR 和MTHFR 基因分型

利用“叶酸代谢相关基因多态性检测试剂盒（荧光PCR 熔解曲线法）”进行检测，严格按照说明书进行操作。通过CFX96实时荧光PCR 仪进行检测和结果分析。

1.3 统计学分析

应用HaploView4.2 软件对研究人群进行MTHFR 677C>T、MTHFR 1298A>C、MTRR 66A>G 多态性位点的Hardy-Weinberg 遗传平衡检验。采用SPSS22.0 软件对获得数据进行统计分析，各地区各民族之间的基因型和等位基因型频率的差异比较采用χ2检验。计量资料采用±s 表示，用t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡分析

对广西苗族女性MTHFR 677C>T、MTHFR 1298A>C、MTRR 66A>G 三个SNP 位点分别进行平衡检验，经拟合优度χ2检验，三个SNP 位点的基因型频率和基因频率处于遗传平衡状态（χ2分别为0.005、0.002 和3.186，P 均＞0.05），表明本研究取样是随机的。

2.2 苗族女性MTHFR、MTRR 基因型和等位基因频率分布情况

500 例广西苗族女性MTHFR 677 CC、CT、TT 的分布频率依次为：72.2%、25.6%、2.2%；MTHFR 1298 AA、AC、CC 的基因型频率分别为54.4%、38.6%和7.0%；MTRR 66 AA、AG、GG 的分布频率依次为49.2%、43.4%和7.4%。MTHFR 677C>T 的C 和T 等位基因频率分别为73.3%和26.7%，MTHFR 1298A>C 的A 和C 等位基因的频率分别73.7%和26.3%，MTRR 66A>G 的A 和C 等位基因频率分别为70.9%和29.1%。

2.3 不同民族女性MTHFR、MTRR 基因多态性位点基因型和等位基因频率比较

不同民族女性MTHFR 677C>T、MTHFR 1298A>C、MTRR 66A>G 基因型及等位基因频率比较见表1 ～3。广西苗族MTHFR 677C>T 的基因型频率与海南黎族[4]、新疆哈萨克族[5]、贵州土家族[6]、贵州苗族[6]、湖南土家族[7]、云南阿昌族[8]、云南傈僳族[8]、西藏藏族[9]女性比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。广西苗族677T 等位基因频率与海南黎族、贵州土家族、贵州苗族、湖南土家族女性比较，差异有统计学意义（P均＜0.05），与新疆哈萨克族、云南阿昌族、云南傈僳族、西藏藏族比较差异无统计学意义（P 均＞0.05）。广西苗族MTHFR 1298A>C 的基因型频率与贵州土家族、贵州苗族、海南黎族、湖南土家族女性比较，差异有统计学意义（P 均＜0.05），而与新疆哈萨克族、云南阿昌族、西藏藏族比较差异无统计学意义（P 均＞0.05）。广西苗族1298C 等位基因频率与贵州土家族、贵州苗族、湖南土家族、云南傈僳族女性比较，差异有统计学意义（P 均＜0.05），与海南黎族、新疆哈萨克族、云南阿昌族、西藏藏族差异无统计学意义（P 均＞0.05）。广西苗族MTRR 66A>G 的基因型频率与海南黎族、新疆哈萨克族、贵州土家族、贵州苗族、西藏藏族女性比较，差异有统计学意义（P ＜0.05），而与湖南土家族、云南阿昌族、云南傈僳族比较差异无统计学意义（P ＞0.05）。广西苗族66G等位基因频率与海南黎族、新疆哈萨克族、贵州土家族、贵州苗族、西藏藏族女性比较，差异有统计学意义（P ＜0.05），与湖南土家族、云南阿昌族、云南傈僳族比较差异无统计学意义（P 均＞0.05）。

表1 不同民族女性MTHFR 677C>T 基因型及等位基因频率比较（%）

表2 不同民族女性MTHFR 1298A>C 基因型及等位基因频率比较（%）

表3 不同民族女性MTRR 66A>G 基因型及等位基因频率比较（%）

3.讨论

2019 年柳州市围产儿出生缺陷总发生率为14.00‰，主要类型包括先天性心脏病、多指（多趾）、外耳其他畸形、尿道下裂、并指（并趾）、唇裂、小耳、腭裂、马蹄内翻足、直肠肛门闭锁、胎儿水肿综合征等。研究表明引起出生缺陷发生的因素主要包括环境因素、遗传因素和营养因素，随着分子遗传学技术的发展，遗传因素的作用显得越来越重要。叶酸和同型半胱氨酸代谢途径的关键酶是MTHFR 和MTRR，其基因多态性与出生缺陷关系密切[1]，此外，这些多态性位点在不同地区分布存在差异，与所在民族居住地的气候、环境、饮食习惯等因素相关[7]。

本研究对广西柳州500 例苗族女性进行了MTHFR 677C>T、MTHFR 1298A>C、MTRR 66A>G位点分布情况调查，并与海南黎族[4]、新疆哈萨克族[5]、贵州土家族[6]、贵州苗族[6]、湖南土家族[7]、云南阿昌族[8]、云南傈僳族[8]、西藏藏族[9]数据进行了比较。本文发现广西苗族677T 等位基因频率高于海南黎族、云南阿昌族、新疆哈萨克族，低于贵州土家族、贵州苗族、湖南土家族、云南傈僳族，不完全遵循由南到北呈现递增趋势，与国内已报道的其它地区和民族情况不太一致[6]，与部分亚洲国家（如约旦和印度）MTHFR 基因677T 等位基因频率分布规律存在差异[6]，提示这种分布规律的原因可能是由紫外线照射强度和饮食习惯引发[6]。MTRR 基因66G 等位基因在少数民族中呈现由南向北逐渐递减的趋势，这一结果与国内学者对部分地区汉族人所做的研究结果相似[6]。基于不同地区、不同民族的遗传特征差异[10]，在制定相关孕期保健方案时，我们需要人性化指导用药。通过开展广西苗族女性 MTHFR 和MTRR 基因多态性的分子流行病学研究，了解本地区少数民族人群的遗传特征，将为当地出生缺陷一级预防和公共卫生政策提供科学依据。