色素上皮衍生因子在脑胶质瘤中的表达及其对胶质瘤治疗作用的研究

孙广玉 王淑燕 李九州 张萍 张莹莹

（山东省滨州市人民医院 山东 滨州 256600）

脑胶质瘤是神经外科最常见的中枢神经系统肿瘤，具有侵袭性和复发性，早期难以通过影像诊断而被发现。目前胶质瘤的治疗以手术切除为主，辅以化疗放疗及免疫治疗和生物治疗等措施。这些方法的治疗效果并不令人满意，主要是治疗后易复发，复发后的肿瘤其恶性程度进一步增加。因此，寻找一种新的、更有效的生物治疗方法，是当前临床迫切需要解决的问题[1]。最近的研究表明，色素上皮衍生因子（PEDF）可以诱导分化并抑制几种肿瘤的血管生成[2]。然而，PEDF 在胶质瘤中的角色仍需进一步研究。在肿瘤血管生成过程中，血管生成相关因子发挥重要的调控作用。这些细胞因子可分为两大类：一类为促进因子如血管内皮生成因子VEGF，另一类为抑制因子例如PEDF、血小板反应蛋白TSP-1[3]。这两类因子在胶质瘤发展过程中是否具有相互调控作用尚不清楚，了解它们之间的调控关系将在抗血管生成方面为脑胶质瘤的有效治疗提供有力证据。因此，本文着重探讨色素上皮衍生因子（PEDF）在脑胶质瘤患者组织中的表达与临床病症的相关性及其对胶质瘤血管生成方面的调控作用。

1.资料与方法

1.1 一般资料

在患者知情同意下，选择2017 年5 月—2018 年12 月我院收治的80 例脑胶质瘤患者，收集它们的临床资料。术后的脑胶质瘤组织行免疫组织化学染色检测PEDF 的表达。在进行PEDF 的表达与临床病理特征相关性分析时，主要从性别、年龄、临床分期等方面进行评估。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞样品的获得 将重组蛋白rPEDF 加入脑胶质瘤细胞A172 中（A172PEDF），同时以未加入PEDF 蛋白的脑胶质瘤细胞作为对照（A172con），24 小时后取培养液并收集细胞分别检测VEGF、TSP-1 胞外分泌量和细胞内表达量。

1.2.2 酶联免疫吸附实验 根据试剂盒说明书，取细胞培养液加入单抗包被的检测孔内，经过孵育、加生物素标记的二抗、孵育、加反应液和终止液等步骤，在酶标仪上测定每孔吸光度（A）值，按标准曲线计算蛋白浓度。

1.2.3 蛋白免疫印迹 收取的细胞加入RIPA 裂解液冰上裂解30min 后，BCA 法进行总蛋白定量后，变性并煮沸后的蛋白样品经SDS-PAGE 电泳、转膜、封闭、孵育第一抗体和第二抗体步骤后，显色检测蛋白表达情况。蛋白条带用Image J 软件进行灰度分析。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism7 软件进行数据处理，计数资料行χ2检验，采用n（%）表示，计量资料行t 检验，采用（）表示，P ＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 PEDF 的表达与脑胶质瘤患者的临床病理特征分析

为了研究PEDF 在脑胶质瘤发展中的作用，我们对80 份胶质瘤组织切片行免疫组织化学染色以测定PEDF 的表达。通过配对患者的临床资料特征后，我们将PEDF 的阳性表达与患者的临床病症进行相关性分析。数据分析表明，脑胶质瘤患者的PEDF的表达与性别、年龄无关，而与胶质瘤的临床分期有一定的相关性（P ＜0.05）。这一结果提示，PEDF 在恶性程度较低的患者脑胶质瘤组织中表达相对丰富，见表1 和图1。

表1 PEDF 的表达与脑胶质瘤患者的临床病理特征分析

图1 PEDF 的表达与脑胶质瘤患者临床分期的相关性

2.2 PEDF 对脑胶质瘤细胞中的VEGF 和TSP-1 表达的调控

为了进一步探讨PEDF 对脑胶质瘤发展的调控作用，我们用体外重组蛋白rPEDF 处理胶质瘤细胞，并检测血管生成相关因子的表达。经免疫吸附法测定后，相比于A172con，A172PEDF 细胞培养液中VEGF 含量有所减少，TSP-1 的含量有所增加（P ＜0.05）。蛋白免疫印迹实验可以得到类似的结果，相比于对照组，在A172PEDF 细胞中，VEGF 的表达显著降低，而TSP-1 的表达则显著上升，见表2 和图2。我们的结果表明，PEDF 可通过调控血管生成关键因子的表达发挥抗肿瘤作用。

表2 rPEDF 对脑胶质瘤细胞中VEGF 和TSP-1 表达的影响（）

表2 rPEDF 对脑胶质瘤细胞中VEGF 和TSP-1 表达的影响（）

注：（细胞外分泌，单位µg/ml）

检测项目 A172con A172PEDF VEGF 1.23±0.06 0.66±0.09 TSP-1 346±87 1848±142 P＜0.05 ＜0.05

图2 rPEDF 对脑胶质瘤细胞中VEGF 和TSP-1 表达的影响（细胞内，A172con 为对照）

3.讨论

本研究中，通过对脑胶质瘤患者的临床病症与他们胶质瘤组织中PEDF的表达进行相关性分析证实PEDF的表达与患者性别、年龄无关，而与临床分期有一密切的关系（P ＜0.05）。同时，通过分子生物学手段探究了PEDF 对脑胶质瘤细胞中某些癌症发生发展相关分子表达的调控作用，证实PEDF 可调节VEGF 的下调表达，同时上调TSP-1 的表达（P ＜0.05）。

临床研究证明，PEDF 在正常脑组织的表达量是胶质瘤组织中的数倍[4]。这与我们的研究结果有相似之处，即恶性程度低的胶质瘤组织中PEDF 蛋白表达阳性率反而更高。PEDF 在中枢神经系统的作用主要包括促进神经元细胞存活、充当视网膜母细胞瘤细胞的神经营养蛋白，因此在胶质瘤组织中PEDF 的低表达可能是导致胶质瘤发展的重要因素[5]。此外研究证实，PEDF 既是一种神经营养因子，又是一种内源性新生血管抑制剂[6]。与PEDF 抑制新生血管生成、抗肿瘤和促进肿瘤细胞分化等多种功能不同的是，VEGF 可促进血管内皮细胞增殖、分化从而促进新生血管形成，在肿瘤的生长、浸润和转移过程中起到重要作用。最新的研究也显示它在中枢神经系统肿瘤中发挥重要的调控作用[7]。TSP-1 作为首先被发现的内源性抗血管生成因子之一，它具有抑制内皮细胞增殖、迁移和毛细血管形成的功能。我们的研究证实，在胶质瘤细胞中，PEDF 可显著调控VEGF 和TSP-1 的表达。这样，PEDF可以在抑制血管生成方面发挥抑制肿瘤的作用。然而，本研究仍然存在不足，例如缺乏体内实验的依据。我们计划下一步开展PEDF 对裸鼠胶质瘤模型的治疗研究。

综上所述，基于临床分析和细胞学实验结果表明，PEDF 与脑胶质瘤患者疾病严重程度密切相关，同时是影响肿瘤新生血管形成的主要调控因子。PEDF 表达情况与胶质瘤的恶性程度及血管生成呈负相关，PEDF有可能成为胶质瘤生物学治疗的一种有效的新方法。