复合SDF-1的PLGA材料促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖和迁移初探

姜杨 李永涛 徐桂清 郭林娜 张彧婷 沈雷 姚立杰 王玉

（1齐齐哈尔医学院解剖学教研室 黑龙江 齐齐哈尔 161006）

（2齐齐哈尔医学院基础医学院 黑龙江 齐齐哈尔 161006）

（3齐齐哈尔医学院细胞生物学教研室 黑龙江 齐齐哈尔 161006）

引言

目前，组织工程技术的快速发展，早已成为许多学者研究的热点，但组织工程学修复损伤肌腱的研究还是很少。肌腱损伤治疗还停留在传统的治疗手段上，如缝合、移植等，治疗后也会出现肌腱重复断裂，对患者造成精神和身体上一定痛苦。随着组织工程技术的开展，有些学者提出组织工程手段修复损伤肌腱，为治疗肌腱损伤提供一个新的治疗方法。姜任武等[1]将MSCs培养在支架上，放于跟腱损伤部位，8周后复合物与肌腱融合，无瘢痕形成。本实验研究选取的种子细胞为骨髓间充质干细胞，支架材料为PLGA高分子材料。

骨髓间充质干细胞（BMSCs）是目前组织工程最理想的种子细胞，获得容易，来源于骨髓，属于来源发育早期中胚层一类成体干细胞，优点具有多向分化性特性和自我更新能力，其取材方便，能在体外贴壁、增殖生长的细胞。很多学者通过实验研究得出间充质干细胞在一定诱导条件下可以分化成软骨细胞、成骨细胞、成脂肪细胞，促进损失组织愈合作用[2]。目前研究乳酸-乙醇酸（PLGA）是目前理想的生物组织支架材料，其特点具有生物相容性、降解性好以及较好的力学性能，应用在纳米医学范畴内[3]。在高分子生物支架上加入缓释一定浓度趋化因子SDF-1，趋化因子是细胞因子家族中小分子蛋白质，具有趋化作用的[4]。SDF-1（又称CXCL12），属于趋化家族中的一员，有学者研究：与配体CXCR4结合成生物轴，形成CXCL12∕CXCR4轴，其轴是调控间充质干细胞向损伤部位迁移发挥重要作用[5]。CXCL12∕CXCR4轴同时增加间充质干细胞生存活性及增殖等作用[6]。本实验通过组织工程手段研究趋化因子SDF-1复合PLGA支架材料，观察骨髓间充质干细胞种植在复合支架上的增殖和趋化能力。

1.材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

胎牛血清（美国Gibco），DMEM培养基（美国HyClone），青链霉素（美国Gibco），胰蛋白酶（Sigma 公司），4%多聚甲醛，大鼠SDF-1（美国Abcam），PLGA（上海聚睿生物公司）。

超净工作台，二氧化碳恒温细胞培养箱，倒置显微镜（日本Olympus），Transwell小室（美国Corning），CCK-8试剂盒（碧云天）Emax 酶标仪为（美国 Molecular Devices），高速离心机（德国Eppendorf），震荡仪（跃进仪器厂），静电纺丝机（SS-2535DC）。

1.2 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养：取2～4周龄SD大鼠（齐齐哈尔医学院动物中心提供），体重100g左右，断颈处死，分离股骨，无菌环境下处理取大鼠股骨两端剪开，3mlPBS培养基冲洗骨髓腔1～2次，离心管收集细胞悬液1000r/s，离心5～10min，用枪头吸出上清液，加入培养液，用培养液吹均匀离心管下层组织，放入25cm2培养瓶培养，放入37℃，5%CO2细胞培养箱内，12～24h观察换液，观察细胞培养瓶有雾状细胞聚集，慢慢去除未贴壁细胞，之后每3d进行换液。倒置显微镜观察细胞形态、状态，细胞长满培养瓶底80%～90%进行消化和传代，第三代间充质干细胞应用进行实验研究。

1.3 聚乳酸-乙醇酸纳米高分子材料制备

将PLGA材料溶于六氟异丙醇和冰醋酸溶液中，制备3%比重聚合物溶液，在室温下放在搅拌器上，用磁力棒搅拌，混匀，一般24小时左右。打开静电纺丝机电源预热，推注器选用2.5ml注射器，喷丝直径0.5mm，速度0.6mL∕h，电极距离12cm，铝箔接收后放入干燥箱内，-80℃保存。

1.4 缓释SDF-1的纳米材料制备

壳聚糖缓释SDF-1到聚乳酸-乙醇酸纳米高分子材料，并进行紫外照射灭菌。

1.5 将BMSCs加入缓释SDF-1的纳米材料

将4×105个BMSCs滴加到缓释SDF-1聚乳酸-乙醇酸纳米高分子材料上，37℃，5%CO2细胞培养箱培养，激光共聚焦显微镜观察。

1.6 培养各组细胞（BMSCs对照组、BMSCs+PLGA组、缓释SDF-1复合PLGA生物纤维肌腱+BMSCs组）24小时，提取各组细胞上清液。

1.7 CCK8实验检测各组BMSCs细胞增殖能力

按照CCK-8试剂盒说明书进行操作，取对数生长期的BMSCs细胞，取将第三代间充质干细胞用胰蛋白酶消化1～2min，计数细胞，实验组取1×105个MSC滴加到壳聚糖缓释SDF-1到聚乳酸-乙醇酸纳米高分子材料，对照组取1×105cells/mL密度直接接种于96孔板，每孔加入培养液200μL，放入37℃、5%CO2培养箱培养1天等待贴壁，给予换液，每组设5个复孔。分别在第1天、3天、5天弃掉原培养液，加入CCK-8溶液10μl，培养4小时，使用酶标仪在450nm波长下检测各孔吸光度（OD值），取5孔平均值作为各组实验结果。

1.8 Transwell实验检测各组细胞体外迁移的影响

按照Transwell试剂盒说明书进行操作，将第三代骨髓间充质干细胞用0.25%胰蛋白酶消化1～2min，细胞计数器调整骨髓间充质干细胞密度1×105个/mL，取细胞悬液200μL加入Transwell小室的上室，下室分别为500μLDMEM含120ng/ml浓度SDF-1因子复合PLGA上清液的培养液和含PLGA上清液的培养液，对照组为500μL的DMEM培养液，每组设3个复孔，37℃，5%CO2培养箱内培养12h，培养结束后4%多聚甲醛固定20min，0.1%结晶紫染色20min，在倒置显微镜下观察，每个复孔随机选取5个视野进行拍照统计穿膜细胞数。

1.9 统计学分析

实验所有数据使用SPSS18.0软件统计学分析，结果以（±s）表示，配对样本进行t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 各组CCK-8细胞增殖实验比较

BMSCs对照组、BMSCs+PLGA组、缓释SDF-1复合PLGA材料+ BMSCs组，各组间充质干细胞活性的影响。结果S-BP实验组细胞活性比BP组细胞活性增强（P＜0.01），BP组细胞活性比正常对照组细胞活性增强（P＜0.05），具有统计学意义，见表。

表 各实验组BMSCs吸光度(OD值)的比较（±s，n=3）

表 各实验组BMSCs吸光度(OD值)的比较（±s，n=3）

与正常对照组相比较*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 1d 3d 5d正常对照组 0.49±0.03 0.62±0.02 0.68±0.01 BP 组 0.59±0.02* 0.71±0.05* 0.78±0.04*S-BP 组 0.68±0.03* 0.83±0.04** 0.89±0.02**

2.2 各组细胞Transwell迁移实验比较

S-BP实验组与正常对照组比较有显著性差别（P＜0.01），BP组与正常对照组相比较有明显差别（P＜0.05）；具有统计学意义，见图。

图 各实验组BMSCs迁移数量作用的比较（±s，n=3）与正常对照组相比较*P＜0.05，**P＜0.01。

3.讨论

随着现代体育运动热潮的盛行，许多人都加入体育活动中。但是，由于锻炼的方式不恰当或者年龄限制等许多因素，导致肌肉、肌腱损伤或断裂的病例越来越多。据统计全球报道每年超过3000万肌腱损伤案例[7]。目前传统的治疗方式主要是理疗、缝合以及自体或同种异体移植、人工合成材料等，但治疗愈后效果不理想。随着社会科技不断进步，医学治疗手段飞速发展，近年来，许多研究者运用干细胞复合生物支架材料的组织工程手段，加速了损伤肌腱等组织愈合再生[8]。

本研究实验的种子细胞是取材方便、成活率高的大鼠成体骨髓间充质干细胞，BMSCs免疫原性低，分化能力强，是理想的组织工程种子之一。生物支架是生物相容性、降解性好和力学性能好的PLGA高分子材料，可以安全应用于人体内[9]。细胞因子也是组织工程不可缺少的重要组成部分，本实验选择在前期研究的趋化家族因子SDF-1，对间充质干细胞有趋化作用，趋化因子SDF-1与CXCR4结合，激活下游蛋白，招募间充质干细胞归巢到损伤部位，参与修复组织。本实验研究利用趋化因子壳聚糖缓释120ng/ml浓度SDF-1到聚乳酸-乙醇酸纳米高分子材料，再加入一定计数BMSCs放入支架进行联合培养，来观察BMSCs在复合SDF-1的PLGA材料支架上相容性和BMSCs增殖及迁移情况。实验研究结果得出SDF-1因子和BMSCs可粘附在PLGA支架材料，说明PLGA支架材料无毒性；BMSCs在支架上形态呈梭形，生长情况较好，与PLGA支架材料相容性好。CCK-8增殖检测S-BP实验组细胞活性比BP组细胞活性增强（P＜0.01），BP组细胞活性比正常对照组细胞活性增强（P＜0.05）；Transwell细胞迁移实验表明细胞迁移率S-BP实验组与正常对照组比较有显著性差别（P＜0.01），BP组与正常对照组相比较有明显差别（P＜0.05）；复合SDF-1的PLGA支架材料可有效的使骨髓间充质干细胞增殖和迁移。进而我们可以推测出SDF-1趋化因子复合PLGA支架能够使BMSCs增殖并且趋化使BMSCs至损伤肌腱位置，也参与损伤肌腱修复，也为下一步实验的开展提供了实验铺垫。

综上所述，利用组织工程技术促进肌腱组织修复已经成为日益重视的研究领域，复合型生物肌腱材料促进损伤肌腱的修复、再生及血管化是目前很多学者即要解决的问题，本研究通过构建复合SDF-1的PLGA材料支架有效趋化BMSCs迁移，但SDF-1趋化因子复合PLGA支架材料招募BMSCs归巢的机制尚不清楚，还需进一步研究证实。