HPLC法同时测定清热灵颗粒中4种成分的含量

施晓萍 林徐剑 吴俊

（正大青春宝药业有限公司 浙江 杭州 310023）

清热灵颗粒的处方组成为黄芩、连翘、大青叶、甘草。功能与主治为：清热解毒。用于感冒热邪壅肺证，症见发热、咽喉肿痛。清热灵颗粒在《中华人民共和国药典》2015年版一部中含量测定项下只是测定了黄芩中的黄芩苷这一个成分，难以反应出整个药品的质量，有一定的不足[1]。本研究针对目前清热灵颗粒含量测定方法的不足，提供了一种更加合理有效的含量测定方法用于产品的质量控制。

1.仪器与试药

Agilent1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司），色谱柱为 ZORBAX SB-phenyl（250mm×4.6mm，5µm）；KQ-100DE 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BS-224S型电子分析天平（赛多利斯公司）。

甲醇（色谱纯，TEDIA，美国天地），乙腈（色谱纯，TEDIA，美国天地），冰乙酸 （分析纯，杭州化学试剂有限公司）；水为蒸馏水；对照品：黄芩苷（批号：110715-200514），连翘苷（批号：110821-200508），甘草酸铵（批号：110731-200615），靛玉红（批号：0717-200003），均由中国食品药品检定研究院提供；清热灵颗粒，规格：5g/袋，正大青春宝药业有限公司生产。

2.方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-phenyl（250mm×4.6mm，5um）；流动相：0.5%冰乙酸—乙腈，梯度洗脱，洗脱条件见表1；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；波长：280nm（检测黄芩苷）、277nm（检测连翘苷）、252nm（检测甘草酸）、289nm（检测靛玉红）。

表1 流动相梯度洗脱条件

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别取黄芩苷对照品、连翘苷对照品、甘草酸铵对照品、靛玉红对照品适量，精密称定，加入50%乙醇制备，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取已研细混匀的清热灵颗粒3g至具塞锥形瓶中，加入50%乙醇25ml，精密称重，超声处理30分钟，超声频率25khz，超声功率100w。然后取出，放冷。再次称重，用50%乙醇补足减失的重量。摇匀，过滤，取滤液即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察取“2.2.1”项下对照品溶液，按照“2.1”色谱条件，进样测定，以对照品峰面积为X，进样对照品的量为Y，绘制标准曲线并得到回归方程，见表2。

表2 线性关系考察结果

2.3.2 专属性考察将清热灵颗粒处方中黄芩去除，即只有连翘、大青叶、甘草这三味药，按照清热灵颗粒的制法[1]制备成颗粒，按照“2.2.2”供试品溶液制备方法制备成缺黄芩的空白阴性对照溶液。按照上述方法分别制备成缺连翘的空白阴性对照溶液、缺甘草的空白阴性对照溶液以及缺甘大青叶的空白阴性对照溶液。将上述空白阴性对照溶液在“2.1”色谱条件下进样，结果：各缺味药材的空白阴性对照溶液色谱图中，在含量测定成分的色谱峰保留时间处无其它色谱峰出现，表明该方法专属性验证无干扰。

2.3.3 精密度考察（重复性试验、中间精密度试验）

2.3.3.1 重复性试验 按照“2.2.2”供试品溶液制备方法配制6份供试品溶液，在“2.1”色谱条件下测定清热灵颗粒中黄芩苷、连翘苷、甘草酸、靛玉红的含量，考察各成分含量RSD。每袋清热灵颗粒中黄芩苷平均含量为89.60mg，RSD为1.78%；连翘苷平均含量为4.13mg，RSD为1.52%；甘草酸平均含量为3.76mg，RSD为1.23%；靛玉红平均含量为0.0564mg，RSD为1.03%。

2.3.3.2 中间精密度试验 3位操作人员采用同一台设备进行测定，方法同重复性试验，考察不同操作人员所测得各成分含量RSD。3位操作人员所测得每袋清热灵颗粒中黄芩苷平均含量分别为89.60mg、89.21mg、88.14mg，RSD为0.85%；连翘苷平均含量分别为4.13mg、4.29mg、4.26mg，RSD为2.01%；甘草酸平均含量分别为3.76mg、3.82mg、3.84mg，RSD为1.09%；靛玉红平均含量分别为0.0564mg、0.0558mg、0.0555mg，RSD为0.82%。

2.3.4 准确度考察（回收率试验） 取已知含量的清热灵颗粒样品6份，取样量为1.5g，加入一定量的对照品或对照品溶液，按照“2.2.2”供试品溶液的制备方法，在“2.1”色谱条件下测定含量，计算回收率，结果：黄芩苷平均回收率为100.74%，RSD为0.90%；连翘苷平均回收率为101.70%，RSD为1.68%；甘草酸平均回收率为99.17%，RSD为1.72%；靛玉红平均回收率为99.59%，RSD为1.08%。

2.3.5 溶液稳定性考察 取清热灵颗粒供试品溶液，在“2.1”色谱条件下，分别在0、2、4、12、16、24h进样测得各成分峰面积，计算RSD。结果：黄芩苷峰面积RSD为1.64%；连翘苷峰面积RSD为1.76%；甘草酸峰面积RSD为1.19%；靛玉红峰面积RSD为0.98%。表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.4 样品测定

按照“2.2.2”供试品溶液制备方法制备10个不同批次的清热灵颗粒供试品溶液，在“2.1”色谱条件下测定各成分的含量。结果见表3。

3.讨论

本实验比较了各种流动相洗脱系统以及梯度洗脱条件，分别为蒸馏水—乙腈、0.3%冰乙酸—乙腈、0.5%冰乙酸—乙腈、1%冰乙酸—乙腈，最终优选0.5%冰乙酸—乙腈为流动相进行梯度洗脱。还比较了不同色谱柱ZORBAX SB-C18和 ZORBAX SB-phenyl，采用ZORBAX SB-C18色谱柱时对黄芩苷色谱峰未有良好的分离，而采用ZORBAX SB-phenyl色谱柱时各含量测定成分的色谱峰均有良好的分离。同时比较了不同提取溶剂（蒸馏水、50%乙醇、70%乙醇、无水乙醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇）对供试品的超声提取研究，从4个含测成分的色谱峰峰面积以及分离度等方面考虑，优选50%乙醇。且比较了超声提取时间（10、20、30min），优选超声提取时间为30min。

对于一个中药复方制剂来说，仅仅检测其中一味药物的一种成分作为含量测定的标准是远远不够的。本研究的清热灵颗粒的含量测定方法为在同一色谱条件下同时测定黄芩中的黄芩苷含量、连翘中的连翘苷含量、甘草中的甘草酸含量以及大青叶中的靛玉红含量。且方法学验证完全符合规定，是一种先进的质量控制方法。相对于一般中药复方制剂如果要用高效液相色谱法检测不同成分的含量需要不同的色谱条件，因此需要大量的检测时间及检测成本，而采用本方法则能节约时间和检测成本，且能更加有效地控制产品的质量和更加全面地反映产品的品质。

表3 样品含量测定结果