微柱离心分离盐酸川芎嗪脂质体与游离药物的研究

陈俊杰

（广州中医药大学中药学院 广东 广州 510000）

脂质体包封率是评价脂质体的重要指标,中国药典2010版脂质体制剂的指导原则指出脂质体包封率不得小于80%。测定脂质体包封率的方法有很多,一般为首先分离游离药物,再测定被包封药物或游离药物,从而计算出包封率。分离脂质体与游离药物可采用微柱离心法、超速离心法、透析法、凝胶柱层析法、超滤法、鱼精蛋白沉淀法等[1]。各种方法各有优劣，但葡聚糖微型凝胶柱先后被 Fry[2]、New[3]和 ElMaghraby[4]采用，这种方法不仅洗脱速度快(一般为几分至十几分钟),而且大大减少葡聚糖凝胶的用量,微柱仅需葡聚糖凝胶约0. 5 g,而常规柱用量为5～8 g。

1.仪器与材料

SpectraMax i3x 多功能酶标仪,SartoriusCP225D型电子分析天平，Sephadex G 50葡聚糖凝胶,大豆磷卵磷脂（阿拉丁）,胆固醇(阿拉丁),盐酸川芎嗪(成都瑞芬生物科技有限公司),维生素E（阿拉丁），十八胺（阿拉丁）,甲醇(分析纯，广州试剂厂)其他试剂(分析纯,市售)。

2.方法

2.1 分离脂质体与盐酸川芎嗪的建立

2.1.1 供试品制备空白脂质体的制备：精密称取大豆卵磷脂100mg、胆固醇14.28mg、十八胺10mg、维生素E10mg于100ml圆底烧瓶，加入5ml无水乙醇超声溶解，于45℃水浴中，减压旋转蒸发30min，形成均匀薄膜；向圆底烧瓶中加入5ml纯化水常压旋转水化1h后置于冰水浴中超声，并过0.2μm纤维滤膜整理，即得空白脂质体。

盐酸川芎嗪溶液的制备：精密称取盐酸川芎嗪20mg置于10ml容量瓶，加纯化水定容，即得。

2.1 2G-50葡聚糖凝胶微柱的制备去一次性1ml注射器，弃去活塞和针头，以适量脱脂棉填入管底，置13mm*100mm试管中，以3000r/min离心3min脱水，凝胶体积缩减，形成与管壁分离的凝胶柱，重复装填，离心，至0.90～1.00ml刻度即可。

2.1.3 操作步骤精密量取0.1ml空白脂质体与盐酸川芎嗪溶液于葡聚糖凝胶微柱柱顶各三份，以3000r/min离心3min使样品进入凝胶柱中，再分别于柱顶加入0.1ml纯化水，以2000r/min离心3min，重复加水、离心10次，收集每次的洗脱液以甲醇定容至1ml，取0.5ml至于96孔酶标板中，以甲醇：水为9：1为空白对照于290nm处测定吸光度，并绘制吸光度洗脱曲线（图1）。

图1

3.结果与讨论

从图1看出以2000r/min离心3min，经7次洗脱才把脂质体完全洗脱下来，但盐酸川芎嗪也接近洗脱下来，空白脂质体与盐酸川芎嗪的分离度不足；以3000r/min离心3min3-4次足以把空白脂质体完全洗脱，且第7次后盐酸川芎嗪才被洗脱出，两个样品的分离度比较好；4000r/min离心3min的洗脱曲线则显示出空白脂质体一开始就被洗脱出来，但考虑到微柱装在玻璃试管中离心，离心转速不宜过大以免玻璃试管碎裂，最终选择使用葡聚糖凝胶微柱以3000r/min离心3min为分离盐酸川芎嗪脂质体与游离盐酸川芎嗪的实验方法。本方法既能利用葡聚糖凝胶柱的洗脱性能，又可减少葡聚糖的用量，增加洗脱效率。，