顺铂诱导的急性肾脏损伤中KIM-1的作用研究

吴敬莹

（安徽医科大学第二附属医院药学部 安徽 合肥 230601）

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI），原名急性肾衰竭，是临床常见危重病之一，其以肾功能在短时间内突然迅速下降为主要特点，并同时伴有一系列严重并发症，临床发病率逐年递增[1]，为目前住院患者死亡的独立危险因素之一。近年来大量的流行病学和临床研究表明肾脏损伤因子-1（Kidney Injury Molecule-1，KIM-1）在肾脏损伤不同程度时会发生显著变化，在肾脏疾病演变全过程中有着重要的意义，KIM-1系肾脏近曲小管上皮细胞一种跨膜糖蛋白，于正常肾组织表达量极低[2]。国外学者Kumar研究提示，在肾缺血、肾毒性等诱因所致的急性肾损伤患者中检测到KIM-1表达水平显著升高，探究原因其细胞外域经基质金属蛋白酶作用分解为可溶性片段并释放到细胞外，随后排入尿液中[3]。AKI在临床早期通常为可逆性损害，如能早期诊断，同时积极针对原发病治疗，消除诱因可有效避免其进展为实质性肾衰竭，但鉴于此类疾病初期临床症状及体征缺乏特征性，在临床实际诊疗过程中极易出现误诊或漏诊，导致部分患者错失临床治疗的最佳时机[4]，故寻找有效的控制因子对于肾脏疾病尤其控制早期肾脏损伤具有重要的意义。

顺铂（Cis-diamine dichloropl atinum，CDDP）是临床最常用治疗实体性肿瘤疗效确切的药物之一，其临床疗效多与临床用药剂量成相关，但其药物毒性尤其肾毒性也与剂量正相关。CDDP的生物活性取决于人体内环境中氯离子浓度，在氯离子浓度较高的血液及细胞外，CDDP相对稳定，一旦其进入氯离子浓度很低的细胞液中后，CDDP中的两个氯离子会被水所取代，形成水合物。而形成的这种水合物极易与DNA发生加成反应，形成交联，破坏DNA的复制转录，导致细胞增殖周期停滞，致使细胞凋亡。探究CDDP诱发肾毒性原因，发现其主要原因是由氧化应激引起的氧化性损伤，损伤机制主要有二：一为大量氧自由基的生成，二则是自由基清除剂减少、受抑。本文就CDDP诱导的鼠急性肾损伤中KIM-1的作用进行研究和探讨，旨在为肾脏损伤早期寻找有效的控制因子。

1.资料与方法

1.1 一般资料

自安徽医科大学实验动物中心购买健康清洁级雄性C57小鼠20只，体质量17～20g，动物使用许可证号（SYXK（皖）2017-006）。按随机数字表法将小鼠分为实验组和对照组，每组10只；正常喂养1周后进行实验。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 实验组小鼠按10mg/kg腹腔注射CDDP，以造成小鼠急性肾损伤模型。对照组给予等量0.9%氯化钠溶液（生理盐水）。

1.2.2 样本采集 用戊巴比妥钠麻醉小鼠（10%，麻醉后处死），取各组小鼠肾脏组织。-80°冰箱保存，对小鼠肾脏组织进行剥离，中间段进行病理学检测，两边进行提取组织蛋白进而对相应蛋白含量进行检测。

1.2.3 免疫组织化学检测 取每组10只小鼠肾脏组织固定24h后，按常规制作蜡块、切片，进行KIM-1免疫组织化学检测。

1.2.4 Westernblot检测 称量组织1000mg肾脏组织，加入10μl蛋白裂解液（1ml RIPA:10μl PMSF），于冰上裂解30min，不间断晃动培养瓶或六孔板；再将裂解液、细胞碎片转至预冷的1.5mlEP管中，涡旋数次至裂解充分；经过4℃，12000rpm，30min离心后；移入上清液至新的1.5mlEP管中（记录上清液体积）；蛋白定量；加入5×蛋白上样缓冲液，4个体积的蛋白溶液加一个体积的5×蛋白上样缓冲液，混匀，分装于0.5ml EP管中；100℃，10min，使蛋白充分变性；提取符合浓度纯度要求的蛋白，置-20℃保存。

Westernblot显影结果采用Image-Pro Plus图像处理系统进行分析光密度，量化蛋白表达水平。

1.3 统计学方法

数据处理采用SPSS17.0软件。计量资料用均数±标准差表示，采用重复测量方差分析；计数资料以率表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 模型结果

2.1.1 免疫组织化学结果 肾脏病理结果显示，实验组小鼠肾脏KIM-1阳性表达显著增高，对照组小鼠肾脏损伤因子棕黄色阳性表达相对于模型组显著减少（图1）。

图1 两组肾脏组织免疫组织化学检查结果图

2.2 Westernblot结果

两组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）（图2）。

图2 Westernblot结果

3.讨论

本实验研究旨在建立顺铂（Cis-diamine dichloro platinum，CDDP）诱导的急性肾损伤小鼠模型，检测KIM-1在此模型中小鼠肾脏表达的不同。目前CDDP导致急性肾毒性的机制未完全明了，部分学者研究提示CDDP摄入机体内后能在肾组织浓聚，排泄途径主要为经肾排泄，而这种肾组织浓集的特征性组织分布、以及主要由肾排泄特性，可能是其肾毒性的原因所在[5]。实验通过CDDP的肾毒性诱导肾小管上皮细胞的坏死、细胞凋亡、炎症介质损伤等机制产生急性肾损伤。目前研究表明KIM-1作为一种新Ⅰ型跨膜糖蛋白，其结构包括胞质区、跨膜区、信号肽、黏蛋白结构域、特征性Ig结构域等，通常KIM-1在正常肝、肾及脾组织呈微量或低量表达，但在急性肾损伤后再生的近曲小管上皮细胞中表达量显著提高，提示与急性肾损伤严重程度相关性强，表明其在肾小管上皮细胞早期损伤及修复、肾间质纤维化修复中均具有重要作用，同时具有信号传导、黏附及参与免疫反应等功能。研究提示KIM-1细胞外域经基质金属蛋白酶作用分解为可溶性片段，并释放到细胞外，随后排入尿液中，故可于尿液中检测出KIM-1可溶性片段。学者赵进等研究提示，在临床肾缺血导致急性肾小管坏死患者尿液中，KIM-1表达水平显著升高，KIM-1尿液中测定值为其他急性肾损伤因素导致的急性肾小管坏死患者数值约4倍，其次诱因是临床造影使用的对比剂所致的急性肾小管坏死[6]。

笔者动物实验结果同样显示，在实验组中病理学水平和蛋白水平均呈现出KIM-1的高表达，无论肾毒性还是肾缺血所致肾损伤，尿KIM-1作为评估肾损伤的标志物优于BUNSCR及尿NAGL这些传统的指标。因此提示KIM-1是种可靠的早期检测肾损伤的生物学标志物。