应用荧光定量PCR技术检测小儿尿液中人巨细胞病毒

袁成立

【中图分类号】R821.4+2       【文献标识码】B     【文章编号】2095-6851（2020）06-069-01

巨细胞病毒（CMV）感染主要源自于人巨细胞病毒（HCMV） ，具有较强易感性，可在任意季节肆意增殖，临床研究表明该病成人感染率高达95%，而大部分患者感染该病后无明显症状表现，病毒潜伏期较长。而一旦感染体免疫功能弱化，则可直接激活潜伏病毒，导致靶器官伤损伤，情况严重下可致死。

巨细胞病毒的主要靶器官主要针对肝脏、呼吸系统、神经系统以及血液系统。由于儿童（包括婴儿、新生儿）的抵抗力、免疫力较低，感染风险较高，临床症状主要表现为黄疸、溶血性贫血或智力低下等，可致畸、致残甚至致死。新生儿感染CMV的主要因素及途径是HCMV母婴传播，HCMV可直接穿透胎盘而造成感染。有研究指出，孕妇CMV若为非活动性感染，则发生垂直传导传播的风险较低，因此CMV DNA阳性不可作为终止妊娠的独立危险证据。若病毒DNA含量少，几乎不影响正常妊娠。而对此现阶段随着特异性抗CMV病毒更昔洛韦等药物的广泛应用，如何早期、迅速且精确诊断CMV感染，是检测CMV感染程度及动态，开展合理治疗与评估疗效、预后的关键依据。

现阶段诊断HCMN感染的金标准主要是病原体分离，而因分离技术条件较差且分离时间较长，临床实验室内难以广泛应用。近年多使用血清学及分子生物学等方法辅助诊断HCMN感染。但结合上文所述，新生儿的HCMV-IgG抗体表达婴儿后期经胎盘获取的母体抗体，最多只能存在约18个月，因此也无法作为诊断儿童HCMV感染的唯一依据。而经IgM试验假阳性与假阴性过于一致，加之儿童的体液免疫系统尚未完善，免疫应答有效性存在一定局限性，因此血清学方法不宜适用于检查诊断HCMN感染。

EISA是现阶段临床应用率较高的检测技术之一，采用EISA法检测CMVIgM抗体是临床诊断活动性CMV的关键指标，主要出现于感染后3～5d，持续发展3～6个月，大多表示为近期活动性感染;若为IgM阴性，推断可能原因为处于感染初期，尚不具抗体或感染后抗体完全消失。而IgM阳性并不是诊断原发性感染的金标准，无法作为诊断CMV的唯一证据。由于风湿因子，以往遗留感染及疱疹病毒产生交叉反应，均可造成假阳性，且无法作为评估药物疗效与患者预后状况的定性、定量指标。

而FQ-PCR可迅速且定量检测CMV DNA，该技术基于荧光信号检测PCR产物，其不仅显著提升灵敏度，同时具有PCR循环一次即可采集一个数据的优势，实时构建增发曲线，精确明确CT值，进而凭借该CT值明确始末的DNA拷贝指数。相较于常规PCR，其优势在于特异性强、灵敏度高、定量精确、设备线上实检测、结果简易可视化等，可防止医师主观判断，检测重复性较好，自动化可操控性较高，此外有效规避了PCR污染问题。其灵敏度是每个反应体系的100个病毒粒子，大于常规PCR检测敏感性约1±0.5个数量级，且检测的有效线性范围得到拓宽，可动态检测体内CMV。其主要根据基因扩增数量及趋势，作为病情、预后评估的实质性依据，可精确反映所用药物是否对病原体浓度的变化产生影响，有助于评估药效，为后续用药方案的制定提供实质性的参考。

CMV侵入管道上皮细胞的风险较高，尤其是肾脏、肝胆系统。病毒集中于肾小管，CMV主要在肾小球、肾小管上皮细胞内繁殖，经尿液排出。由于尿液具有较强的浓缩功能，因而尿液中病毒含量通常较高。其次HCMN可在细胞内发生和发展，而血液中仅可释放少量病毒，加之检测方法存在一定局限性，其检出病毒含量较少，很大程度上是造成FQ-PCR血液标本阳性率较低的关键因素。因而可借助尿液检测CMV DNA，检出阳性率较高。加之采集儿童尿液的便捷性优于血液，后期药物治疗、随访中均可采集标本实现持续性检测，有利于提升检测动态结果的实效性。而目前临床已有大量研究证实，检测尿CMVDNA可为诊断婴幼儿CMV感染提供实质性的辅助。

临床有相关研究对75例临床疑似患有HCMV活动性感染患儿的血、尿标本中，检出尿液HCMV阳性57例，检出率高达达77.33%，高于常规pp65抗原检测的64.22%，由此可见FQ- PCR检测HCMV的敏感性、精确性明顯高于常规pp65抗原血症检测。而两项检测结果的一致性高达（86.78%），因此可表明，尿液中检出高浓度的HCMV可作为有效提示体内病毒活跃程度的关键依据。而该项实验中，两种检测方法均检出3例阳性标本，本文结合以上论述，推断原因可能在于各个群体宿主免疫状态的差异、HCMV潜伏后重新激活感染的病理表现、症状表现均具有一定差异等。考虑到HCMV感染的临床表现较为综合、复杂，因而临床上务必综合判断分析各指征，保证及时、精确、合理诊断HCMV的发生、发展与分化。

总的来说，将尿液作为临床检测小儿HCMV感染的一线标本，具有取材便捷、前期预处理便捷、结果敏感性高等优点，对临床及时诊断CMV感染与疗效评估具有实质性的辅助价值，且一定程度上有助于改善妊娠结局，防止分娩畸形儿，切实保障母婴健康。而对CMV DNA的检测而言，将作为诊断CMV感染继续以标准化、多元化优创新创效发展的引领方向。