多重连接依赖的探针扩增检测Rett综合征患儿大片段缺失

张晓英

【摘要】目的：筛查Rett 综合征（Rett syndrome， RTT）患儿甲基化CpG结合蛋白2（methyl-CpG-binding protein2，MECP2）基因大片段缺失及重复。方法：采用多重连接依赖的探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification， MLPA）方法对88例确诊RTT（PCR及测序未见MECP2突变）患儿进行此基因突变分析。结果：MECP2大片段缺失的突变筛出率为11%，除外1例非典型RTT，其余均为典型RTT，且9例涉及第3和/或第4外显子。结论：MLPA作为MECP2筛查的重要补充，典型及非典型患儿都应进行。

【关键词】多重连接依赖的探针扩增;Rett 综合征

【中图分类号】R729【文献标识码】【文章编号】2095-6851（2019）02-249-01

近年来多重连接依赖的探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification， MLPA）技术广泛应用于基因检测、基因诊断等多个领域[1-3]。Rett综合征（ Rett syndrome ， RTT）是一种严重影响儿童精神运动发育的X连锁显性神经遗传病，其主要的致病基因为甲基化CpG结合蛋白2（methyl-CpG-binding protein2，MECP2）[4-5]，MECP2大片段缺失等复杂重排约占基因突变总数的6～23 %[6-8]。本文对88例PCR及测序未见MECP2突变的患儿行MLPA，研究其基因突变特点，为临床诊断提供重要实验室依据。

1对象和方法

1.1对象PCR及直接测序方法没有检测到MECP2突变的患儿88例，均符合RTT的诊断标准[9]，包括典型RTT 67例，非典型RTT 21例。年龄1岁5月～16岁，中位数3岁，均为女性。患儿家长均签署知情同意书，并填写患儿临床资料调查表。

1.2方法

1.2.1DNA纯化取患儿及其父母外周静脉抗凝血 5～ 10 mL提取DNA（蛋白酶K-氯化钠盐析法）[10]。选用北京天根生化科技有限公司生产的DNA纯化试剂盒对DNA进行纯化，按照试剂盒具体步骤进行DNA纯化。

1.2.2 MLPA进行MECP2突变分析 3μL 纯化的DNA加入0.2mL EP管放置在PCR仪（Eppendorf公司，德国）98°C变性5分钟后，降温至25°C加入1.5μL的混合液（0.75μL probemix+0.75μL MLPA buffer），95°C 反应1分钟后降温至60°C孵育16～18小时。温度降至54°C时加入16μL连接反应混合液（1.5μL Ligase-65 buffer A、1.5μL Ligase-65 buffer B、0.5μL Ligase-65 和12.5μL去离子水），混匀。54°C孵育15分钟进行连接反应，98°C 5分钟灭活连接酶后降温至20°C，加入5μL PCR混合液（1μL SALSA 引物、0.25μL SALSA聚合酶和3.75μL 去离子水）混匀后进行PCR反应。95°C 反应5分钟后，95°C 变性45秒，60°C 退火30秒，72°C延伸1分钟，共35个循环，最终72°C延伸5分钟。所用试剂盒P015E1由荷兰MRC-Holland公司生产。

扩增后的PCR产物用DNA测序仪ABI3310（Applied Biosystems， Foster， USA）進行MECP2突变分析，最终所得数据用GeneMarker软件进行分析。以被测样品与对照组的峰值进行比较，比值为1示基因剂量无变异，比值小于0.70以下提示基因缺失，比值大于1.3提示基因重复。

2结果

对88例患儿进行MLPA分析， 发现10例（包括9例典型RTT及1例非典型RTT）大片段缺失，约占其总数11 % （10/88）。大片段缺失的患儿中9例（90%，9/10）涉及外显子3和/或4，仅1例（10%，1/10）涉及第一外显子，表1。

3讨论

2002年荷兰科学家Schouten等[11]最先报道了MLPA技术，其将核酸的杂交检测和PCR链式扩增相结合。至今已发展为一种核酸检测技术，广泛应用于科研及临床。MLPA主要包括探针与DNA样本的杂交、连接和扩增三个关键的步骤，通过设计的专一探针组可粘合至目标序列。若完全粘合，则连接酶会将两条探针连接为片段。然后利用通用引物组进行PCR反应，将连接片段扩增。若目标序列缺失或发生突变，则两条探针无法连接成功，即不会产生相应扩增产物。通用引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增产物长度都是唯一的，扩增产物可以通过毛细管电泳分离对结果进行分析。MLPA实现靶分子的高效特异性分析，其核心技术是合成序列特异的长探针和短探针。RTT作为女性智力低下最常见的病因之一，根据临床表现可分为典型和不典型病例[9]。MECP2突变为RTT主要的致病基因[4-5]，目前已发现的MECP2突变达500多种（http;//mecp2.chw.edu.au），先前报道MLPA发现 MECP2大片段缺失及复杂重排约占总突变病例的6～23% [6-8]。Scala等[12]对77例测序未见MECP2突变RTT患儿（33例典型患儿，31例非典型及13例RTT样患儿）进行MLPA突变分析，结果发现16例（21%，16/77）MECP2大片段缺失，包括15例（45%，15/33）典型患儿及1例（3%，1/31）非典型患儿。其中2例（13%，2/16）涉及第1、第2外显子缺失，其余14例（88%，14/16）均涉及第3、第4外显子缺失。Hardwick等[13]在149例测序未见MECP2突变患儿中仅发现12例（8%，12/149）大片段缺失患儿，其中5例（50%，5/10）是典型患儿，5例（50%，5/10）非典型RTT，还有1例先天性脑病患儿;12例患儿中11例（92%，11/12）涉及第3、第4外显子缺失。本研究对88例测序未见MECP2突变RTT患儿行MLPA筛查基因有无大片段缺失及重复，结果发现10例大片段缺失患儿，MLPA筛出率约11%。其中9例为典型患儿，仅1例为非典型RTT。大片段缺失的患儿中90%（9例，9/10）均涉及外显子3和/或4，仅1例（10%，1/10）涉及外显子1和2（del 1～2）。结果与Scala等及Hardwick等报道相似，典型RTT和非典型RTT患儿都可见MECP2大片段缺，且缺失区域主要涉及第3和/或第4外显子。国外有研究表明[14] MECP2在3 到TRD有一个高度重复区域（deletion prone region， DPR），C-末端发生基因内缺失的断点常常位于此区域，而C-末端突变影响转录调控过程中MECP2与DNA结合能力。本研究中9例大片段缺失涉及DPR，且这些突变与上述报道相似[14]。此外，国外已有数例MECP2重复突变报道[15-17]，但本次筛查未见基因重复。

本研究对88例测序未见MECP2突变RTT患儿行MLPA筛查，结果显示10例大片段缺失患儿中90%为典型患儿，且90%均涉及外显子3和/或4。MECP2作为RTT患儿的主要致病基因，测序等未见突变患儿应行MLPA筛查患儿有无大片段缺失及复杂重排等基因突变，且典型及非典型患儿都应进行筛查，为临床诊断提供重要支持。

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