结直肠癌中长非编码RNA MT1DP的下调与其不良预后密切

潘军平+王俊+朱新华+吴亚夫+丁义涛

【摘要】目的：探讨假性基因（MT1DP）在结直肠癌（CRC）组织及其癌旁组织中的表达水平，及假性基因（MT1DP）的表达与结直肠癌（CRC）预后的相关性。方法：我们研究了78例患者的CRC组织及其癌旁组织，通过实时定量PCR检测MT1DP的mRNA表达水平，并进一步评估其在结直肠癌中的临床价值。结果：在78例CRC组织中有55例的MT1DP表达水平显著下降（70.5%，P<0.001）。此外，CRC中MT1DP的表达水平与TNM分期（P=0.020）和远处转移（P=0.005）密切相关。而且，CRC患者中低MT1DP表达者的总体生存率（OS）及无病生存率（DFS）更低（P分别为0.002和0.006）。另外，单因素和多因素Cox回归分析进一步明确MT1DP低表达可能是CRC患者的OS和DFS的独立预后因素。结论：研究结果表明MT1DP低表达与CRC的发生发展密切相关，其有望成为结直肠癌患者一种新的诊断以及预后评价的生物标志物。

【关键词】结直肠癌；长非编码RNAs；MT1DP；预后

【中图分类号】R735.3 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2017）06-00-01

1.引言：

大量证据表明lncRNAs表达异常与疾病的多样性密切相关，包括人类恶性肿瘤[5，6]。在结直肠癌中，lncRNAs表达异常与肿瘤生长及转移密切关联，而且其中一些在诊断与预测中颇具价值，例如：CCAT1[7]，HOTAIR[8]，UCA1[9]和MALAT1[10]在结直肠癌中高表达，而长链非编码RNALET[11]，MEG3[12]，GAS5[13]以及LOC285194[14]在结直肠癌组织中低表达。

最近发现肝癌中一种新的lncRNA，即金属硫蛋白1D假性基因（MT1DP），它可以作为一种肿瘤抑制基因抑制肝癌细胞生长。然而，结直肠癌中MT1DP表达与其潜在的临床病理学作用之间的关系尚不明。在本研究中，我们旨在探索MT1DP在CRC组织及癌旁组织中的表达水平。以及其表达水平与结直肠癌患者临床病理学特征及预后价值的关系。

2.材料与方法：

2.1 患者的组织样本

本研究共收集78例人体CRC组织及邻近正常组织。所有患者均为近两年在南京大学医学院附属鼓楼医院接受结直肠癌手术的患者。入组均未接受术前放疗或化疗。组织样本在外科手术离体后立即以液氮冷冻并储存在-80℃用于进一步分析。患者详细的临床特征列于表1。随访数据通过审查门诊患者及通过电话或邮件随访患者。总生存期从最初的外科手术日期算起，直到死亡日期或随访的最后日期。该项目方案由南京大学和江苏省医学会伦理委员会通过，所有患者签署知情同意书。

2.2 RNA分离和定量实时逆转录PCR（QRT-PCR）

根据TRlozol试剂说明书（Invitrogen公司）提取组织样本的所有RNA。RNA的浓度及纯度以分光光度法在260nm和280nm处测定，只有A260/A280的OD值接近1.8～2.0的样本进行随后的分析。使用PrimeScriptTMFirstStrandcDNA试剂盒（Takara，大连，中国）并根据其说明书进行反转录。qRT-PCR使用SYBRPremixExTaqTMII试剂盒（Takara公司），AppliedBiosystems7500PCRSystem（ABI，TX，USA）。MT1DP引物序列为5-ATTTCTGAGGCGAGAGGACT-3（正向）和5-GCAGGAGCAGCAGTTCTTCT-3（逆向）。GAPDH（内参）序列为5-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3（正向）and5-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3（逆向）。PCR扩增方案如下：95℃下5分钟，在95℃下30秒进行40个循环变性，在58℃下30秒退火，在72℃下20秒延伸。所有反应一式三份进行，比较循环阈值（CT）的方法和方程2-ΔΔCT用于量化MT1DP的表达水平。

3.统计分析：

组间差异的显著性应用Studentst检验，检验或Wilcoxon检验进行评价。建立受试者工作特征（ROC）曲线评价诊断价值。生存曲线构建使用Kaplan-Meier方法和通过对数秩检验进行比较。单因素和多因素分析在Cox比例风险回顾模型基础上进行。所有统计分析使用SPSS18.0软件（SPSS，Chicago，IL，USA）。双侧P值小于0.05时认为差异有统计学意义。

4.结果：

4.1 MT1DP在CRC患者中表达下调

如图1A，B所示，与癌旁组织相比，MT1DP在肿瘤组织中表达明显下降，P<0.001。78例CRC患者中有55例肿瘤组织MT1DP的表达水平低于癌旁组织70.5%），肿瘤组织比癌旁组织中MT1DP的表达水平低1.52倍。

4.2 CRC中MT1DP下调的診断价值

我们发现ROC曲线下面积（AUC）为0.714，95%可信区间（Cl）为0.636-0.783，灵敏度为88.46%（95%Cl：79.2-94.6），特异性为51.28%（95%Cl：39.7-62.8），Youden指数（J=0.3974）为最大值，P<0.001。（图2）。

4.3 CRC患者MT1DP表达与临床特征的关系

我们根据78例CRC患者肿瘤组织中MT1DP表达水平的中位数为界，将78例患者分为低MT1DP组（n=39）和高MT1DP组（n=39）。结果表明，CRC中MT1DP低水平组与TNM分期（P=0.020）及远处转移（P=0.005）存在显著相关性。相反的，MT1DP表达与其他临床参数如年龄（P=0.365）、性别（P=0.610）、肿瘤大小（P=0.103）、肿瘤位置（P=0.640）和肿瘤分化程度（P=0.147）之间无关联（表1）。

4.4 MT1DP表达与CRC患者预后的关联

生存分析表明，被分到两组的患者的总存活率（OS）和无病生存率（DFS）的顯著差异是基于他们MT1DP表达水平的差异。具体表现为CRC患者中MT1DP低表达者的OS和DFS低于那些MT1DP高表达者（对数秩检验，P=0.002和0.006，分别如图3A，3B）。

另外，Cox比例风险分析用于进一步评估MT1DP表达在CRC中对预后判断的价值。单因素生存分析显示，肿瘤大小、肿瘤分化程度、TNM分期、远处转移和MT1DP表达与CRC患者的OS和DFS显著相关（所有P<0.05）。相反的，其他临床病理参数，如年龄、性别和肿瘤位置不是具有统计学差异的预后因子（所有P>0.05，表2）。随后，多因素Cox比例风险分析显示MT1DP表达、TNM分期和远处转移与CRC患者的OS和DFS显著相关（所有P<0.05，表2），这提示MT1DP可能是CRC的一个独立预后因素。

5.讨论

CRC仍是导致全球癌症相关死亡的主要原因之一，其致死的主要原因是肿瘤的侵袭性及转移[16-18]。根据癌症统计，大约60%的CRC患者处于转移的进展状态。尽管最近已发展出多种治疗方法，中晚期CRC患者预后仍然很差。

在本次研究中，我们提供了一种新的候选生物标记物，即MT1DP，用于CRC的诊断、预后判断和治疗。基于78例CRC患者肿瘤与癌旁组织的qRT-PCR结果，我们发现与癌旁组织相比，MT1DP在CRC组织中显著下调。ROC曲线表明MT1DP表达水平在CRC中具有潜在的诊断价值。我们也发现CRC中MT1DP低表达与TNM分期和远处转移密切先关，这提示MT1DP表达情况可以帮助我们预测CRC肿瘤分期和判断进展程度。连同前面肝癌研究中的发现，即MT1DP可以抑制肝癌细胞增殖和表型改变[15]，我们的数据显示MT1DP可能在CRC致癌过程中发挥肿瘤抑制物的作用。

另一方面，我们的Kaplan-Meier分析表明MT1DP表达与CRC患者的OS和DFS密切关联。另外，单因素和多因素Cox风险比例分析进一步揭示MT1DP可能是CRC患者OS和DFS的独立预后因素。因此，MT1DP可能有助于确定具有较高死亡风险的高风险CRC患者，并可能成为一种更积极的、有效的治疗的候选靶点。

总的来说，我们目前的研究首次报道了结直肠癌组织样本中MT1DP水平的下调与结直肠癌患者的不良预后密切相关。此外，MT1DP有望成为结直肠癌患者预后的独立危险因素。为结直肠癌患者的诊断及预后评估提供一条新途径。

参考文献

[1]Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics.CA Cancer J Clin 2011；61：69-90.

[2]Morris V，Kopetz S.Clinical biomarkers in colorectal cancer.Clin Adv Hematol Oncol 2013；11：768-76.