大鼠脊髓右半横断损伤模型的制备及其评价

决利利

【摘要】目的：通过制备大鼠脊髓损伤模型，观察其脊髓损伤后行为，为今后进一步对脊髓损伤的研究提供较为可靠的实验用模型。方法：构建大鼠脊髓损伤模型，随机分为假手术组和脊髓右半横断损伤组。分别在损伤前、损伤后定期进行BBB功能评分，连续观察大鼠脊髓损伤后运动功能恢复情况。结果：假手术组在不同的时间BBB评分均很高，而脊髓损伤组评分较低。结论：通过本研究所制备的大鼠脊髓右半横断损伤模型，操作简便、稳定可靠、易于复制，对脊髓损伤的研究具有一定的使用价值。

【关键词】脊髓损伤；模型；BBB评分

【中图分类号】R681 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2017）06-0-01

前言

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是中枢神经系统的严重创伤，通过制备脊髓损伤模型来研究治疗脊髓损伤疾病是临床上常用的必要手段，而进行脊髓损伤基础研究的前提就是建立一个适宜的脊髓损伤模型[1]。本研究结合现在临床治疗脊髓损伤的需求，建立了脊髓右半横断损伤模型。

1.材料与方法

1.1 实验动物 健康成年SD大鼠共39只，雌雄不限，体重250～300g，由贵州医科大学动物实验中心提供，统一标准饲料喂养。

1.2 方法 将39只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、脊髓右半横断损伤1d、1w、2w、3w、4w共6组，每组6只，中间淘汰3只。实验观察时间分别在脊髓损伤1d、1w、2w、3w、4w。实验用动物购入后常规饲养1周，观察其健康状况及四肢活动情况，无异常后，各脊髓损伤组大鼠腹腔注射5%水合氯醛（6ml/kg）麻醉，俯卧位固定于自制的木板上，常规消毒后剪去背部脊椎区毛。75%酒精消毒后，沿T9～T10背部正中线棘突作2～3cm长的切口，切开皮下脂肪和深筋膜直达棘突及棘上韧带，将椎旁肌从棘突和椎板表面剥离牵开，咬除棘突和椎板。脊髓背部正中剪开长3.5mm长纵向切口，沿正中作3mm长纵向切口贯穿脊髓，横向剪断去除右侧脊髓。大鼠迅速出现摆尾反射，右侧后肢及躯体回缩扑动后右后肢瘫痪，提示造模成功。仔细止血，生理盐水、甲硝唑依次冲洗创腔，逐层缝合硬膜、椎旁肌、筋膜及皮肤，再次常规消毒皮肤，无菌纱布覆盖。假手术组只咬除棘突和椎板不损伤脊髓，其他步骤同脊髓损伤组操作[2]。

1.3 形态学观察 将各实验组SD大鼠在各时间点用5%水合氯醛经腹腔麻醉后，切取以损伤处为中心长约1.5cm的脊髓组织，4%多聚甲醛固定24h，冰冻切片，经Nissl染色后观察脊髓损伤的病理变化。

1.4 行为学观察 本实验采用BBB（Basso，Beattie，andBresnahanLocomotorRatingScale）[3]運动功能评分法分别对假手术组和脊髓损伤各组进行脊髓神经功能恢复情况的评价。

1.5 统计学方法 本实验内容数据采用SPSS17.0软件进行统计处理。实验数据用均数±标准差（±s）表示，各组数据采用单因素方差分析（ANOVA），以P<0.05表示有显著性差异，以P<0.01表示有非常显著性差异。

2.结果

2.1 术后一般情况

术后所有大鼠手术切口处皮肤愈合良好，无感染，缝线大多在2～3周内自行脱落，大鼠右侧后肢肌肉有不同程度萎缩，左侧后肢术后行动不便者也大约在1周内恢复。脊髓损伤组个别大鼠发生右侧足趾被自行咬伤，甚至造成足趾脱落，与右侧脊髓半横断损伤后右侧后肢瘫痪及感觉异常有关。极少数大鼠还会出现腹腔积液的表现，推测可能是由于尿潴留或者手术创伤导致的急性肾衰所致。在整个实验过程中大鼠死亡多因麻醉意外，而感染、自伤、失血过多等原因则少见。故在手术过程中，应严格控制麻醉剂量，根据大鼠术前兴奋的程度酌情增减麻药的剂量，另外在手术过程中应严格遵循无菌操作原则，避免粗暴的动作和过多损伤动物的组织结构，术后给予精心的护理，分笼饲养，常换笼中垫料等。

2.2 术后后肢功能观察

术后假手术组双后肢功能正常，脊髓损伤组大鼠双后肢均出现瘫痪，1周内损伤处皮下瘀血消除，左侧后肢功能一般能恢复正常；术后1周内活动较少，1周以后可用双前肢拖曳身体及后肢行走，以后右侧后肢自主活动随着损伤时间的延长有不同程度的恢复。

2.3 脊髓损伤后形态学变化

经Nissl染色后观察，假手术组染色结果无差异，可见尼氏体分布均匀、丰富、颗粒状且染色较深。脊髓损伤后1d组可见损伤处尼氏体较少，甚至溶解消失；脊髓损伤后1w至4w时损伤处尼氏小体胞质内开始出现小空泡或颗粒样变性；在脊髓损伤2w至4w，损伤处开始有囊腔形成，随着脊髓损伤时间的延长在囊腔的边缘尼氏小体数量增多且集中，而囊腔内的尼氏小体数量极少。

2.4 运动功能评价

脊髓损伤后各实验组的BBB评分结果见附表。每组随机分为6只进行BBB评分。BBB评分结果显示（见附表），假手术组大鼠后肢运动功能于1d后基本正常恢复21分；脊髓损伤1d时各实验组大鼠的后肢BBB评分均为0分，伤后1w功能有恢复，随后的观察时间点评分逐渐增高，4w时评分达到最高值。从附表可见到伤后4w的BBB评分恢复明显高于伤后1d至1w（P<0.05）。

3.讨论

根据脊髓局部解剖的连续性和完整性特征，我们可将常见的实验性脊髓损伤模型分为非横断性和横断性SCI模型两种。非横断性SCI模型没有明显的脊髓解剖连续性和完整性的中断，常用于急、慢性脊髓损伤机制及药物干预的研究[4-5]。Allen打击脊髓损伤模型被认为是一种简便易行、控制性好，可定量且与临床脊髓损伤机制相似的经典方法，从而广泛应用于脊髓损伤的各项研究当中[6]，然而它也有一定的局限性[7]。脊髓缺血性损伤模型、钳夹模型、脊髓压迫动物模型，因其操作难度或应用范围较小而未获得广泛的应用。横断性脊髓损伤模型有明显的脊髓解剖连续性和完整性的中断，见于严重的钝性打击伤、切割伤及火器伤。目前对脊髓损伤后神经功能恢复所进行的动物实验研究，主要是采用锐利的刀片选择性的对脊髓进行全横切和半横切，从而观察损伤区域轴突再生、突触重建及有关神经递质、细胞移植、神经营养因子等对这一过程的影响及作用。

脊髓损伤后的运动功能评分是评估脊髓损伤程度、观察脊髓损伤后损伤脊髓自我修复与再生能力的重要措施。BBB评分是目前应用最广泛的脊髓损伤评价方法，可作为评价大鼠脊髓损伤后运动功能恢复的标准评分方案之一，其评价内容包括身体协调性和后肢運动幅度等多个方面。但此方法易因为主观因素使其结果失真，所以本研究利用双盲、双人独立评分并取其平均值的方法，尽可能提高运动功能评价的准确性。

目前，国内外学者针对治疗脊髓损伤的实验研究很多，涉及到的研究面很广，主要有干细胞移植[8]、局部植入神经支架[2]及药物治疗[9]等，但至今未找到行之有效的治疗方法。因此建立一种可靠、简单、实用的脊髓损伤模型是研究脊髓损伤的先决条件。本实验通过制备与临床上脊髓损伤患者相似的动物实验模型，在一定程度上模拟人类脊髓损伤后的病理改变和临床表现。为研究脊髓受损后神经修复及运动功能改善提供实验用模型。

综上所述，在制备脊髓损伤模型时，研究者应根据其实验目的和具体实验条件做出科学的选择。通过本实验方法建立大鼠脊髓右半横断损伤模型，制作过程简单且易于复制，可用于临床治疗脊髓损伤的相关研究。今后，如何能制造出更加接近临床状态、更加可靠、标准化的脊髓损伤模型，仍是我们今后努力研究的方向。

参考文献

[1]郝琴，韩继明等.脊髓损伤动物模型的制备[J].山东医药，2014，54（39）：100-102.

[2]孙庆治等，局部植入神经干细胞/胶原支架复合体对大鼠脊髓损伤的修复作用观察[J].山东医药，2016，56（43）：44-46.

[3]Basso DM，Beattie MS，Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open filed testing in rats.J Neurotrauma，1995，12（1）1-21.

[4]宗少晖，韦波，曾高峰，等.白介素-1受体拮抗剂对大鼠急性脊髓损伤后BDNF表达的影响[J].实用医学杂志，2011，27（2）：205-206.

[5]周开锋，蒋赞利，茅祖斌，等.17β-雌二醇对大鼠脊髓损伤后神经保护作用的研究[J].中国脊柱脊髓杂志，2007，17（8）：623-627.

[6]Khan T，Havey RM，Sayers ST，et al.Animal models of spinal cord contusion injuries[J].Lab Anim Sci.1999，49（2）：161-172.

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[8]马珊珊，渠瑞娜等.脐带沃顿胶干细胞移植对脊髓损伤大鼠炎症因子表达的影响[J].中国组织工程研究，2015，19（27）：3729-3735.

[9]杨函，王松等.抑制钙蛋白酶对大鼠脊髓损伤后神经功能保护作用研究[J].重庆医科大学学报，2016，41（8）：813-817.