非结核分枝杆菌菌种如何检测鉴定

王小芳

非结核分枝杆菌（nontuberculosismycobacteria，NTM）原来被称之为原称非典型分枝杆菌（atypicalmycobacteria），是指那些除了结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌以及牛分枝杆菌之外的分枝杆菌。NTM在自然环境中普遍存在，可以在自然环境下繁殖并通过空气传播。据相关报道，供水系统是NTM感染的最主要渠道。近年来，随着医务工作者对非结核分枝杆菌（NTM）疾病认识的提高，临床发现越来越多的NTM感染。非结核分枝杆菌的菌种数量多，截止2015年年底，已证实达到173种。不同菌种所致的感染性疾病，影像学极其相似，非结核分枝杆菌感染在症状上难于与结核分枝杆菌感染区别，但治疗方案差异太大，因此把这两种感染区分开来，意义重大。故此，关于非结核分枝杆菌，准确鉴定菌种是临床治疗的前提与保障。

常用NTM的菌种鉴定方法

一 传统方法

1 表型判定：根据生长速度、菌落形态及是否产色等特征，鉴别菌种

在营养丰富、温度适宜的条件下培养，根据生长时间的快慢分为快生长菌和慢生长菌。固体培养基上，结核杆菌生长缓慢，一般需4周时间方可形成1mm（直径）左右菌落，菌落致密且干燥，多呈淡黄色或者黄色，表面粗糙，可见皱纹，边缘不整齐称为慢生长菌。生长快速、可见特殊颜色且菌落形态明显异于结核分枝杆菌复合群（mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTC），考虑存在NTM，可进一步鉴定菌种。

2 生化方法：烟酸产生实验、硝酸盐还原实验，热触酶稳定性、PNB生长实验等。常用方法为PNB生长实验。实验原理是利用结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌在含有对硝基苯甲酸的罗氏培养基上是否生长的特性。根据不同的报道，98%-100%的结核杆菌复合群在含PNB的罗氏培养基上不能够生长，而NTM中除个别种的分枝杆菌，或个别种中的少量菌株外，都能耐受，生长良好。

传统鉴定方法仅根据细菌的生长特点和生化反应进行观察分析判定NTM具有一定的局限性，但是这一方法在我国却得到普遍应用，就是由于该方法操作简单，不需要特殊的技术与设备，价格便宜，具有较高的实用性，故而可达到推广的效果。

二 分子技术

1 聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）

目前，PCR技术在临床上应用较广泛，这些PCR技术扩增靶序列主要是MTC中的特异性DNA序列，包括IS6110、MPT64、CEP-10、ESAT-6等。故此，PCR技术一般需要结合现有涂片及培养技术，初步筛查NTM。针对涂片呈阳性或者培养呈阳性的标本，平行的PCR扩增，结果显示阳性，一般提示样品中有MTC菌，相反的，PCR呈阴性时考虑存在NTM，不过仍需进一步证实。

2 分子诊断技术

直接同源基因或者序列比较法

对同源DNA序列组成差异进行分析，鉴定细菌菌种，这种方法是现目前鉴别菌种的一个“金标准”。现在比较常用的RNA聚合酶的β亚基（ropB）、热休克蛋白65（hsp65）编码基因、16S-23SrRNA基因间区（ITS）、16SRNA编码基因（16SDNA）等，都属于同源序列。若是单单看鉴别能力，hsp65比ropB及ITS更好，而16SDNA最低。

间接同源基因或者序列比較法

同源基因或者序列测定法，虽然鉴别能力强大，但是，因为技术操作难度大，且需要昂贵设备，难以大范围推广应用。故此，间接序列比较法引起了人们的关注与重视。根据特定同源基因或者序列（包括ITS及16sDNA等）特定单核苷酸多态性，设计的位点探针，现目前已经商用，固相基质上面标记探针，根据探针和待检测序列之间的结合情况，对DNA序列组成进行间接判断，鉴别菌种。一般来说，选择单核苷酸多态性位点时，主要依据可鉴别NTM的位点。

第一，线性探针杂交技术。这个技术主要目的在于对样本中的核苷酸序列进行判断，辅助观察非结核分枝杆菌的杂交情况，判断非结核分枝杆菌的菌种。德国HAIN生命科学公司已经研发多款，一次性杂交，便可鉴别MTC与NTM，且可进一步鉴别NTM的菌种。

第二，DNA芯片技术。基因芯片，也称NDA或者是cDNA微阵列，指约1cm的载体上点布诸多不同寡核酸苷或者是DNA探针，和带有标记的待测DNA或者是mRNA进行杂交，根据产生的信号强弱程度，对DNA或者mRNA中和芯片相应基因变异或者表达情况进行判断分析。20世纪80年代开始应用基因芯片技术，国内产品包括博奥生物有限公司生产研发的芯片，适用于鉴别诊断16种NTM。

第三，基因探针。基因探针，是一种用荧光标记出来的单链DNA探针，样品中细菌能够释放出与其互补的rRNA，两者通过杂交，进而产生一种荧光信号，借助特定的设备仪器，对荧光情况进行检测分析，辅助结果判定。这一技术，操作简单，一般1个小时内可完成检测。

3 根据细菌组成成分结构差异，鉴定菌种

较成熟的技术有分枝菌酸结构分析技术（高效液相色谱分析仪）与飞行质谱检测法（MOTITOF飞行质谱技术）。细菌脂质及蛋白质组成，都具备特异性，可据此鉴别。两种方式都适用于阳性培养物，故而临床及时诊断中应用价值不高。通过比较发现，分枝菌酸结构分析技术的操作过程相当复杂，而且试剂的开放度较窄，费用高。飞行质谱检测法这种方法的操作相对简单一点，而且能够实现快速检测，成本也低。但是，需要关注的一点是，以上谈及的两种方法都存在很大的局限性，都需要昂贵的仪器设备才能完成检测，故而在临床中难以得到普遍推广。

4 MPB64抗原检测法

一般来说，可以采取免疫层析法，测定培养滤液中有无MPB64抗原，操作简单，耗时短，无需特殊设备，在初步鉴定MTC与NTM中敏感性高、特异性高。需要关注的一点是，由于MPB64抗原编码基因突变，有一些结核分枝杆菌会呈现出阴性结果，具体可能表现出以下情况：有的卡介苗培养时，没有分泌出MPB64抗原，故而检测呈阴性;（2）海分枝杆菌，可分泌微量MPB64抗原，结果呈弱阳性。MTC与NTM同时存在的情况，检测结果呈阳性，但无法提示存在NTM。

总之，非结核分枝杆菌菌种的检测方法较多，实践操作中，我们可以根据具体条件进行选择，提高测定准确性。