质谱技术在蛋白质糖基化研究中的应用

胡燕娴，孙晋红，潘莹，季芳，康涛，郭嘉杰，邵秀稳

质谱技术在蛋白质糖基化研究中的应用

胡燕娴，孙晋红，潘莹，季芳，康涛，郭嘉杰，邵秀稳

（广东省药品监督管理局审评认证中心，广东 深圳 518000）

随着蛋白质组学研究的不断发展，蛋白质糖基化也越来越受到人们的广泛关注。糖基化修饰是蛋白质翻译后最主要的修饰方式之一，在生物过程中发挥着至关重要的作用。质谱由于操作简便并具有极高的灵敏度和准确度，已成为蛋白质组学中最主要的技术之一，不同原理的质谱在蛋白质糖基化研究具有独特的优势，可进行定性定量分析，包括相对分子量的测定、糖基化位点的鉴定、糖链组成的解析及定量分析等方面。

蛋白质糖基化；质谱技术；糖链；定性定量分析

1 引言

蛋白质糖基化指单糖或寡糖与蛋白质之间通过共价结合形成糖蛋白的过程，50%以上的蛋白质存在糖基化现象[1]。根据蛋白质被糖类修饰形式的不同可以把蛋白质糖基化分为四类：O位糖基化、N位糖基化、C位糖基化及糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定连接。糖基化可改变分子结构的特异性，影响细胞间的识别、黏附、代谢及免疫等过程，从而影响疾病的发生发展过程。例如N-聚糖上的末端残基、唾液酸参与免疫和细胞间通讯[2]。粘附蛋白的糖基化可以在很大程度上影响它们的结合特性，影响细胞-细胞或细胞-基质黏附功能[3]。因此检测蛋白质翻译后修饰的变化，可以确定新的靶点，为疾病的治疗寻找新方法。

有关蛋白质糖基化修饰现象的研究，一方面研究其中的蛋白表征，即鉴定糖基化氨基酸位点；另一方面研究糖蛋白中的糖链表征，即确定糖链的组成及相对分子质量。质谱具有灵敏度高、可获得多种结构信息和适于分析混合物等优点，是糖蛋白定性定量分析的一种理想手段。在质谱中，由于糖蛋白骨架中的糖骨架和蛋白骨架都会有一定的断裂规律，所以根据质谱所得到的图谱可以进行相对分子量的测定、糖基化位点的鉴定、糖链组成的解析及定量等分析工作。

2 质谱（Mass Spectrometry，MS）分析技术

质谱分析技术是在电场和磁场中分析具有不同质量的带电分子、原子或离子碎片，可了解分子量、分子式或者分子结构等方面的信息。应用于蛋白质糖基化研究中的质谱主要有快原子轰击质谱（FAB-MS）、电喷雾电离质谱（ESI-MS）、基质辅助激光解析谱仪（MALDI-MS）等。串联质谱及多级质谱技术已经是研究和应用热点，其对糖链的解析可获得更完整的结构[4]。

2.1 快原子轰击质谱（FAB-MS）

快原子轰击质谱是最早被引入到糖链分析领域的质谱技术，它使用氩或氙等高能粒子照射液态基质中的待测物质分子，分子吸收能量被激发从而碎裂成离子。一般情况下，用快原子轰击得到的主要是分子离子或准分子离子，而碎片离子很少。分析样品无需经过气化而直接电离，操作简便，信号稳定。快原子轰击质谱已被证明是分析糖蛋白结构的一种有力的方法，它不仅可以测定寡糖及其衍生物的相对分子质量（Mr），而且可以测聚合度高于30的糖链的Mr。衍生化可以提高质谱对糖链检测的灵敏度。Okamoto在阴离子和阳离子FAB-MS2两种模式下，分别对天然及2-氨基吡啶（PA）衍生化的唾液酸寡糖进行检测和结构分析，研究表明，经2-PA衍生化唾液酸寡糖的检测灵敏度明显高于未衍生化的寡糖[5]。

2.2 电喷雾电离质谱（ESI-MS）

电喷雾电离质谱是一种通过电喷雾，将溶液中的离子转变为气相离子而进行质谱分析的方法。电喷雾在离化时能量更低，具有较高的离子化效率及灵敏度，分子质量范围更宽，适合各种微量糖链或其衍生物样品的分析。在电喷雾电离质谱中，高分子量的分子通常会带有多个电荷，电荷状态的分布可以精确对分子量定量，同时提供精确的分子质量和结构信息。电喷雾电离质谱能检测非衍生化的糖，可区分非衍生化寡糖的连接方式（O-或N-），确定寡糖的结构、聚合度及组成。对于衍生化糖的测定，电喷雾电离质谱能精确糖蛋白的Mr及结构不均一性，同时确定糖蛋白中寡糖序列和连接方式。

2.3 基质辅助激光解析电离质谱（MALDI-MS）

基质辅助激光解析电离质谱的检测原理是将待测物的溶液和某种基质溶液混合，蒸发溶剂，使待测物与基质成为晶体或者半晶体，再用一定波长的激光进行照射，基质吸收能量后传递给待测物，使被分析物气化从而实现离子化。目前基质辅助激光解析电离质谱仪是一种简单检测癌症和各种组织（包括血液，血清和肌肉）疾病中糖基化改变的常用工具[6]。它是第一个用于检测全血清聚糖谱分析的方法，如用于N-糖链。基质辅助激光解析电离质谱除了用于检测肿瘤标记物外，还有助于进一步阐明复杂生物样品中蛋白质糖基化的特点。不同肿瘤组织具有不同的聚糖谱，基质辅助激光解析电离质谱可在福尔马林固定石蜡包埋组织中定位成像N-聚糖[7]。若基质辅助激光解析谱仪能与飞行时间检测器或其他高性能检测器联合，则能获得更多精准信息。

2.4 串联质谱

2.4.1 液相色谱-电喷雾质谱（LC-MS）

在糖组学和糖蛋白质组学分析中，液相色谱-电喷雾质谱是一种理想有效的研究方法，其可提高分析结果的准确性及提供丰富的糖链信息。液相色谱-电喷雾质谱可分析单糖组成及结构信息，进一步增加了寡糖分析的深度。这种方法是目前用于异构体分离和MS检测的最稳定可靠的方法。亲水相互作用液相色谱（HILIC）已用于分离和标记的聚糖。SONG等人研究显示通过使用液相色谱-电喷雾质谱可检测血清中聚合度超过170的聚糖结构[8]。

2.4.2 毛细管电泳质谱联用（CE-MS）

毛细管电泳质谱联用方法可以获得样本中多种信息，如迁移时间、分子质量及离子碎片信息等[9]。它具有高通量和高分辨率的特点，因而可将其提高样本检测的准确率和效率，基于以上优势可将其用于糖组学和糖蛋白质组学分析中。SUN等将一种新型电动压力的接口技术用于毛细管电泳质谱中，该方法用于鉴定肝素寡糖的结构[10]。

3 应用

3.1 相对分子质量的测定

电喷雾电离质谱或基质辅助激光解析电离质谱可对富集纯化的各种糖链进行相对分子质量检测，从而得到糖链混合物的相对分子质量指纹谱，以获得样品中糖链群体的总体分布特征。毛文君等采用电喷雾质谱准确判断出6种琼胶寡糖的分子量[11]。

3.2 糖链组成的解析

直接进行MSn分析，或者将糖链全甲基化之后进行气相色谱-质谱（GC-MS）分析，可鉴定糖链内部单糖或寡糖的连接方式。GC-MS配置的电子轰击或化学离子化等离子源可以使GC分离后的各种糖链衍生物分别得到充分裂解，依据糖链分子裂解规律对碎片离子产生的质谱信号进行分析，则可以确定糖苷键的类型。

ESI串联质谱可以对MS和MS/MS谱图进行解析，另外，离子肼和傅立叶变换离子回旋共振（FTICR）在分析糖链结构方面有独特优势。采用酶法将所有N-糖链从人血浆蛋白上切割下来，然后通过纯化、富集和回收，得到糖链再经过常规的还原和甲基化，最终用于电喷雾电离质谱及MSn分析，从而确定了人血浆106种N-连接糖链的单糖组成[12]。

3.3 糖基化位点的鉴定

确定糖基化位点的途径主要有两种：①通过寻找糖基特征离子，进而确定糖肽，比如NacGlc特征离子为m/z 204；②通过比对酶处理前后酶解肽图，在总离子流色谱图（TIC）上，酶解前的糖肽峰酶解后消失，出现去糖肽，根据去糖肽的相对分子量及MS/MS图确定糖基化位点。TSARBOPOULOS等分析了重组人白细胞介素-4的糖基化位点及部分糖链结构[13]。

3.4 定量分析

每个物质都有固定的质量，根据质谱图中的峰强可以进行定量分析。基于质谱的糖链定量分析方法主要有绝对定量和相对定量两种，绝对定量需要选待测糖链的标准品，但对于生物样品中复杂的糖链，获得标准品非常困难。目前主要采用内标法进行相对定量研究，即向样品中加入一定量的内标物，通过测量与被分析物的相关响应值进行定量。薛向东等建立了一种基于电喷雾电离质谱的苯胺稳定同位素标记对还性寡糖链进行相对定量分析的研究方法，将其应用于人奶中游离寡糖和牛奶中游离寡糖的分析，结果表明，人奶中的乳糖含量高于牛奶[14]。

4 结束语

在生命活动中，蛋白质作为新陈代谢的承担者，糖基化可改变蛋白质的结构及功能。在一些热门研究领域，如发现肿瘤细胞表面糖基化的改变在肿瘤发生，甚至发展转移中起着重要作用。临床中常用的肿瘤标记物，如CA125、CA199等是肿瘤中异常糖基化的结果。糖蛋白的合成是在多种多样的酶作用下形成，在同种分子的同一糖基化位点，糖链的结构也会存在差异。质谱作为发展新技术，被认为对糖基化分析具有明确的优势，可对各种糖链进行结构分析。相信随着质谱分析技术的不断发展，其在糖蛋白糖基化研究中的应用将极大地拓展对糖蛋白的生物学功能认识。

［1］APWEILER R，HERMJAKOB H，SHARON N.On the frequency of protein glycosylation，as deduced from analysis of the SWISS-PROT database［J］.Biochimica et Biophysica Acta，1999，1473（1）：4-8.

［2］GAURANG P B，KAREN J C.Sialylation of N-glycans：mechanism，cellular compartmentalization and function［J］.Histochemistry and Cell Biology，2017，147（2）：149-174.

［3］SONIA B，CARVALHO S，DIAS A M ， et al.Pancreatic cancer cell glycosylation regulates cell adhesion and invasion through the modulation of α2β1 integrin and e-cadherin function［J］.PLOS ONE，2014，9（5）：85.

［4］ZHANG H T，ZHANG S，TAO G J，et al.Typing of blood-group antigens on neutral oligosaccharides by negative-ion electrospray ionization tandem mass spectrometry［J］.Analytical chemistry，2013，85（12）：9.

［5］OKAMOTO M.A comparative study on structural elucidation of sialyl oligosaccharides by mass spectrometry with fast atom bombardment，electrospray ionization，and matrix assisted laser desorption/ionization［J］. Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2002，65（11）：27.

［6］MUCHENA J K，DAYOUNG P，CARLITO B L.Glycans and glycoproteins as specific biomarkers for cancer［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2017，409（2）：395-410.

［7］POWERS T W ，NEELY B A，YUAN S，et al.MALDI imaging mass spectrometry profiling of n-glycans in formalin-fixed paraffin embedded clinical tissue blocks and tissue microarrays［J］.PLoS ONE，2014，9（9）：106255.

［8］SONG T，ALDREDGE D，LEBRILLA C B.A method for in-depth structural annotation of human serum glycans that yields biological variations［J］.Analytical chemistry，2015，87（15）：62.

［9］MANTOVANI V ，GALEOTTI F，MACCARI F，et al.Recent advances on separation and characterization of human milk oligosaccharides［J］.ELECTROPHORESIS，2016，37（11）：24.

［10］SUN X J，LIN L，LIU X Y，et al.Capillary electrophoresis-mass spectrometry for the analysis of heparin oligosaccharides and low molecular weight heparin［J］.Analytical chemistry，2016，88（3）：43.

［11］毛文君，林洪，管华诗.琼胶寡糖的ESI-MS分析研究［J］.中国水产科学，2001（3）：69-72.

［12］STUMPO K A，REINHOLD V N.The N-glycome of human plasma［J］.Journal of proteome research，2010，9（9）：4823-4830.

［13］TSARBOPOULOS A，PRAMANIK B N ，NAGABHUSHAN T L，et al.Structural analysis of the CHO-derived interleukin-4 by liquid-chromatography/electrospray ionization mass spectrometry［J］.Journal of Mass Spectrometry，1995，30（12）：1752-1763.

［14］薛向东，张萍，王仲孚，等.基于电喷雾电离质谱（ESI-MS）的苯胺稳定同位素标记对还原性寡糖（链）的定性定量分析方法［J］.高等学校化学学报，2010，31（11）：2173-2180.

O657.63

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2019.15.063

2095－6835（2019）15－0151－03

〔编辑：严丽琴〕