γ-聚谷氨酸的合成及应用研究

张隽娴

(1.湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，湖北 武汉 430064；2.农业农村部农产品质量安全风险评估实验室(武汉)，湖北 武汉 430064)

1 引言

γ-聚谷氨酸[γ-poly(glutamic acid)，γ-PGA]是一种由谷氨酸单体通过α-氨基和γ-羧基缩合脱去水分子后，以γ-酰胺键结合形成的聚氨基酸化合物[1]。不同的微生物合成的γ-PGA的相对分子量和分子立体结构各异，相对分子量一般在10万～200万之间。1937年，Ivanovic最早发现炭疽芽胞杆菌可以产生聚谷氨酸，随后不断有学者发现枯草研报杆菌等其他芽孢杆菌都可以产生γ-PGA[2]。γ-PGA是一种高分子阴离子聚合物，具有可食用性和生物可降解性，对人体和环境无害，广泛应用于生产生活各个领域。

2 理化性质

通过酸碱滴定法测得γ-PGA的pKa值为2.23，这与谷氨酸α-羧基的pKa值相当。γ-PGA钠盐的旋光度为-70，平均分子量为1.23×105kDa。通过热性质分析实验，测得其热分解温度为235.9 ℃，熔点为223.5 ℃。通过高效液相色谱法可以测得其中D-谷氨酸和L-谷氨酸的比值稳定在60∶40[3]。

分子量是高聚物的最主要参数之一，可以决定其性质。一般来讲，分子量越大持水性越强，但流变性越难控制，一定程度上增加了生产和应用的成本。目前可以通过多种方法来控制γ-PGA的分子量，一种是通过酸碱、超声波、酶或微生物等对已合成的γ-PGA进行不同程度的降解，另一种是通过调节合成过程中的条件，例如改变碳氮比、无机盐浓度等从而改变代谢产物的分子量[4]。

氨基酸同时具有羧基和羟基，属于两性物质，γ-聚谷氨酸由于其大量游离羧基而具有良好的亲水性和反应活性。γ-PGA溶于水后会形成具一定弹性的凝胶，凝胶弹性会随温度、pH值和无机盐等因素的影响[5]。

3 应用分析

γ-PGA是一种高聚物，不同的分子量导致高聚物性质各异，商业用途也不同[6]。因此，鉴于其优良多变的理化和生物学性质，γ-PGA的用途十分广泛，极具研发和应用潜能。

3.1 在医学中的应用

鉴于良好的亲水性，γ-PGA可作为药物载体，提高缓释性和靶向性。另外，γ-PGA本身可降解，对身体无害，还可以降低药物的毒副作用，增强药物的稳定性。如化疗药物会对病人健康细胞和癌细胞无差别破坏，如果将γ-PGA用于药物载体，可以提高载药量和稳定性，降低对人体的损伤[3]。γ-PGA还可以作为载体，用于疫苗的开发[7]。

γ-PG还不失为一种优良的生物医学材料，可以作用黏合剂，防止手术过程中机体渗血[8]。

3.2 在食品中的应用

γ-PGA由谷氨酸聚合而成，可降解，因而能够作为食品添加剂，例如增稠剂、防冻剂等，用于改善食品的品质和色香味，以及保鲜防腐。

γ-PGA是一种优良的抗冻剂，性质优于常用抗冻剂葡萄糖。而且相比于葡萄糖、无机盐等常用的小分子防冻剂，γ-PGA味道更淡，因此对食味品质影响更小[4]。

有研究表明，γ-PGA可以促进细胞内钙离子的吸收，因此可以作为营养助剂[9]。γ-PGA作为祛涩剂和祛苦剂，可以减少单宁、咖啡因等引起的苦味，提升商品的价值。

3.3 在日化用品中的应用

γ-PGA是一种高聚物，鉴于其超强的吸水性和缓释能力，可以用于化妆品保湿。γ-PGA的保湿效果优于透明质酸，堪称化妆品原料家族中的新“明星”，在日本护肤品品牌中比较常见。

此外，γ-PGA还可以广泛用于制作湿巾、婴儿尿不湿等卫生用品[10]，既保湿又无害。

3.4 在农业中的应用

γ-PGA优良的吸水性和可降解性，在农业领域同样发挥出巨大的作用。日本学者以纳豆中的γ-PGA为原料合成一种纳豆树脂，可以包裹在绿植种子的表面[10]。鉴于其环境友好性能，绿化效果良好的同时也避免了环境污染。

γ-PGA的强持水性使其具有控释和缓释作用，可以作为农业投入品的缓释剂，从而减少投入品的使用。此外，在土壤中加入一定量的γ-PGA，也可以提升土壤的保水性和透气性，减少昼夜温差，利于植物生长。

3.5 在其他领域的应用

γ-PGA可以扮演不同环境下对生物的保护剂，例如用于高渗透压下对微生物的保护。还可以螯合金属离子，应用于重金属污染治理。

γ-PGA的羧基经酯化处理后具有很好的热塑性能，同时可以在自然界迅速降解，是环境友好型塑料的极佳选择，具有非常广阔的市场前景。日本味之素公司已成功开发和量产聚合氨基酸系列产品用于食品包装[11]。

目前，水溶性高分子的生产和消费市场主要在美国、日本等发达国家。随着中国的崛起，中国市场中水溶性高分子开始崭露头角，发展形势良好，相信未来可以在国际市场拥有一定话语权。

4 制备方法

4.1 提取法

γ-PGA最初的生产采用提取法，源自日本纳豆产业。纳豆黏液中含有γ-PGA，用乙醇将纳豆中的γ-PGA粗提取，然后进一步纯化。但是纳豆黏液中γ-PGA的分离纯化存在一定难度，主要原因是存在其它黏性物质的干扰，此外γ-PGA产量本身不高，这就拔高了生产成本，不适合工业化生产。

4.2 化学法合成

肽合成法是最原始的化学合成方法，是指通过条件催化，将谷氨酸单体一个一个连接成肽链，不会发生成环聚合[8]。传统方法反应条件苛刻，步骤繁多，且产率不高，不适合工业化生产，更多地用于γ-PGA科学研究。

二聚体缩聚法是另外一种化学合成法，是指先由两种不同构型的谷氨酸单体反应生成α-甲基谷氨酸，然后再形成二聚体；无数的二聚体在一定的反应条件下形成高聚物，最后去甲基化得到γ-PGA。

化学合成法生产的γ-PGA分子量通常比较小，如果提高分子量则将面临生产成本大幅提高的问题，所以化学合成法难以得到规模化应用。但对于探究γ-PGA的结构如何影响其性质和功能，以及γ-PGA的修饰技术具有研究价值。

4.3 酶法合成

酶法合成即利用生物酶代替化学催化剂，使谷氨酸单体聚合形成γ-PGA。由于生物酶的高效性和专一性，酶法合成γ-PGA的产量高，纯度高，且生产效率高。

工艺简单、速度快，易实现规模化是酶法生产的优点，但酶法合成具有和化学合成法同样的缺点，即聚合物分子量不大；此外，生物酶的生产成本普遍较高，而γ-PGA合成反应所需的谷氨酸转肽酶本身在自然界的活性偏低，因此很大程度上制约了该方法的应用。

4.4 微生物发酵

相对而言，前3种方法大都存在产物分子量小、生产工艺复杂或成本高等劣势，难以大量应用。而利用微生物发酵生产γ-PGA具有不可比拟的优势，包括条件温和、速度快、产率高、成本低、无污染等，广受国内外研究者青睐，逐步成为γ-PGA科研和生产的首要选择。

日本对于微生物生产γ-PGA的研究一直处于世界领先水平，起源于纳豆菌。近年来，我国高校和研究所也有不少致力于微生物发酵法生产γ-PGA的科研团队[12]。现阶段，微生物法生产的探索主要集中于如何利用基因工程手段选育优良菌种。

4.4.1 合成机理

γ-PGA的合成机理至今仍在不断研究中。由于产物中自然存在两种构型的谷氨酸单体，D-谷氨酸的来源成为了研究的核心问题。一般细菌细胞都具有丙氨酸消旋酶，细胞质中瞬间会有D-丙氨酸存在。同理，研究者推测D-谷氨酸也可能由谷氨酸消旋酶作用产生。但因此途径还需要研究探讨。

γ-PGA和谷氨酸单体的供给关系也不清楚，不同的菌株表现各异，甚至相反。谷氨酸依赖性菌株B.subtilis IFO3335是目前研究最深入的生产菌之一，有关研究指出外源性谷氨酸单体并非合成γ-PGA的直接前体，而是发挥着生长调节剂的作用。内源性谷氨酸则由甜酮戊二酸通过两种不同的途径合成。相反Ogawa等人通过14C追踪法研究发现产物γ-PGA中存在14C，也就是说培养基里的谷氨酸会被转化到多聚物中[13]。总体而言，对于谷氨酸依赖性菌株，学界更多认同的观念是菌体靠合成酶将体外来源的谷氨酸单体直接聚合生成γ-PGA。

近年来，随着分子生物学和代谢组学技术的快速发展和广泛应用，γ-PGA合成相关的基因和酶系也逐步被认识。大量研究事实表明：γ-PGA的合成机理不同于普通蛋白质的合成机理，缺少以RNA为模板的步骤，属于非核糖体依赖类型的多肽合成。但相较于其他非核糖体依赖型多肽的合成，γ-PGA又呈现出特别之处，即产物具有高分子量，并且具有两种不同的对映体。Man-Seok等研究了Bacillus subtilis strain DKUNT02的全基因组序列，用于鉴定其高活性γ-PGA的遗传因子[14]。Naggi等研究发现纳豆中枯草芽胞杆菌的质粒不参与γ-PGA的合成[15]。如前文所述，对于γ-PGA合成机理的研究，探明D-谷氨酸如何产生，弄清聚合酶的存在与否是最需要解决的两个关键问题。

4.4.2 生产菌种

据已有研究，γ-PGA的生产菌集中于芽孢杆菌属，其中以枯草芽孢杆菌的研究最为透彻。也有研究发现可以生产γ-PGA的炭疽芽孢杆菌[1]，但显而易见的是炭疽芽孢杆菌并不适合作为工业生产菌。对于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，γ-PGA可以从培养基中较易分离得到，故而成为科研和生产的主要菌种。除了常见的芽胞杆菌以外，也有报道具备γ-聚谷氨酸合成能力的嗜盐真菌，以及真核生物如水蛭的刺细胞[12]。

近年来可见一些有关微生物发酵法生产γ-PGA衍生物、混合物的研究报道，拓宽了γ-PGA的应用范围。有研究者发现枯草芽胞杆菌C1可以产生一种γ-PGA和甘油的结合物，而且作为非谷氨酸依赖型菌株，还具有生产成本较低的优势[3]。秦国宏等人利用枯草芽胞杆菌发酵实现γ-PGA和纳豆激酶的联产，且产量都达到了单独合成时的水平[16]。

不同菌株的发酵对培养基成分的要求各异。需要提供外源性谷氨酸的为谷氨酸依赖型菌株，自身可以合成谷氨酸单体的为非谷氨酸依赖型菌株。谷氨酸依赖型产生菌的γ-PGA产量较高，研究更为深入，例如B.licheniformis ATCC9945a和B.subtilis IFO3335。但从节约生产成本的角度考量，非谷氨酸依赖型产生菌发酵更具吸引力，因此实际生产应用的需求促进了各国学者对非谷氨酸依赖型菌种的研究。

在高产菌种的选育研究中，传统的物理和化学诱变技术多有应用。如李楠以纳豆芽胞杆菌S004为出发菌，经诱变选育后得到S004-50-01菌株，γ-PGA产量由原菌株的4.25 g/L提高到10.0 g/L，对谷氨酸的利用率由18.2%提高到42.83%[17]。随着基因工程技术发展的不断深入，其在微生物育种研究中应用越来越广泛，对于γ-PGA高产菌的选育也不例外。Nagai等人将高产γ-PGA的编码基因高频率地转换到无γ-PGA产生能力的菌株中，成功使其产生了大量的γ-PGA[18]。Chuan-Mei通过将调控序列导入BCA基因上游获得了γ-PGA高产突变株[19]。相较于传统的随机诱变技术，基因工程手段的应用使育种技术得到了很大提升。

4.4.3 发酵方式

发酵方式通常以培养基的形态来分类，包括液态发酵和固态发酵，其中前者更为常见。有研究将大豆作为γ-聚谷氨酸生产的培养基，为固体发酵提供了研究素材[11]。该研究发现，大豆发酵还可以产生其他有用的代谢产物，例如维生素K2和纳豆激酶等。固态发酵的培养基通常可以直接采用天然物质，无需分离提纯其中的营养成分，因此来源广泛，工艺简单，成本低廉。另外，固态发酵产物的分离纯化相比于液体发酵来说较易。因此，固态发酵的应用前景非常可观。

值得一提的是，有研究者利用联合发酵的巧思，大大提高了原料利用率，简化了中间过程。联合发酵即以前端发酵的产物作为后端发酵的培养基。研究选择一种L-谷氨酸产生菌和一种γ-PGA产生菌，后者以前者的发酵产物L-谷氨酸为原料合成γ-PGA。前端发酵产生足量L-谷氨酸后，再将后端发酵菌种接种到培养基中，经37 ℃、pH7.0培养24 h后，得到γ-PGA的最高产量为32.8 g/L[20]。偶联发酵方式的开发，避免了谷氨酸提纯的难题，提高了培养基的利用率，压缩了生产成本。不过也面临γ-PGA产量不高的弊端，需要进一步优化。

4.4.4 发酵条件

除了筛选优良菌种，还可以通过调节发酵条件来达到增产的目的。γ-PGA生产菌大多为芽孢杆菌，繁殖力强，适用于一般革兰氏阳性菌的中性发酵条件[21]。培养基中碳源和氮源的浓度及比例是决定γ-PGA产量的核心因素，生长因子如Twee-80、二甲亚砜和甘油也可以促进γ-PGA的合成[22]。

4.4.4.1 谷氨酸

由于非谷氨酸依赖型菌株的γ-PGA产量较低，在现有科研及应用中更常见的是谷氨酸依赖型菌株。当外界提供的谷氨酸单体充足时，菌体利用γ-PGA合成酶将谷氨酸单体合成为γ-PGA，分泌至体外，在发酵液中不断积累。由此可知，外源性谷氨酸的增加可以促进产物的积累。从微生物代谢的普遍规律来看，一方面，当原料谷氨酸单体的浓度增加到一定程度时，其利用率会缓慢降低，也就是说产物的增幅会减小[21]；另一方面，随着发酵液中产物的不断积累，过量的γ-PGA会反过来抑制其产生。因此，谷氨酸单体的添加量需要在平衡生产成本的前提下找到最优值，而非越高越好。

4.4.4.2 碳源

碳源是菌体生长繁殖必需的元素，是培养基中最主要的成分。γ-PGA菌株发酵所需的碳源约是所合成的γ-PGA总量的2-20倍。常见的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉等都可以作为γ-PGA产生菌的碳源，已知的研究中葡萄糖和柠檬酸盐应用较多。考虑到规模化生产，宜用柠檬酸盐做碳源，可降低成本[23]。杨革的研究也提到，柠檬酸是γ-PGA合成的最佳碳源[5]。不同的菌株对不同碳源的利用率各异，有利用单一碳源的菌株，也有将多种碳源按一定配比组合利用的菌株。

4.4.4.3 金属离子

生物酶活性的高低往往与盐离子息息相关。因此盐离子也是影响γ-PGA的性质的重要因素。菌体的生长和代谢产物的合成对金属离子的需求可能不同。研究发现，锰离子对于枯草芽孢杆菌的繁殖必不可少，当锰离子浓度不断升高，转而益于代谢产物的产生[5]。在Bacillus subtilis NX-2发酵生产γ-PGA中，研究者发现不同浓度的Mn2+还可以调控氨基酸异构体的比例[24]。

4.4.4.4 溶氧

常见的γ-PGA高产菌株均为好氧菌，目前大多采用液体发酵模式。而液体发酵则面临如何保持氧气浓度的问题，尤其对于芽孢杆菌来说，代谢产物中的多糖导致发酵液黏度较高，随着发酵产物的积累，液体传质效率越来越低，只能通过不断加大人工通氧和增加搅拌来缓解。因此培养基利用率低，而生产成本高。有γ-PGA研究者成功转化了贝氏硫杆菌中的血红蛋白基因，解决了溶氧难题[11]。通过基因克隆的手段明显提高了菌体发酵中的氧利用率，同时又不影响目标产物的生产和积累，达到了有效降低生产成本的目的。此法在γ-PGA的发酵生产中有望得到更多的研究与应用。

5 展望

纵观各种γ-PGA合成方法，微生物发酵法是最具有科研和应用潜力的。但目前我国γ-PGA微生物发酵基本还处于实验室研究阶段，近年初步开始工业化试生产。试生产中难免遇到问题，通常为生产成本居高不下，生产效率却提不上去。因此，高效、低成本的γ-PGA发酵生产亟待开发。譬如寻找廉价氮源代替发酵培养基中的蛋白胨是一个改进的方向。近年来有研究者利用Bacillus subtilis发酵酒精生产废液，提取γ-PGA，变废为宝，增加了社会和经济效益。

生产中依然存在一些技术难题，例如由于发酵液黏度高而难以有效通氧和分离提纯目标产物，大大制约了γ-PGA发酵生产能力的提升。此外，合成γ-PGA的常用菌在γ-PGA合成过程中其降解途径也同时被启动，反过来抑制产物的积累。现如今，分子生物学技术的发展日趋成熟，在工业生产中的应用也越来越广泛，通过基因克隆的方法构建性状优良的γ-PGA工程菌，将有效解决现有的技术难题，为微生物发酵产业的壮大贡献力量。

日本的氨基酸产业发展旺盛，相关科研也走在国际领先水平[2]。相对而言，我国氨基酸产业的发展相对滞后，尤其在产品精深加工市场与国际领先水平存在明显差距。国内企业应加大科研投入，提高产品精加工能力，力求生产和出口精品，创造更多价值，而非始终拘于原料产品或者粗品市场。要重视科研，以加快微生物发酵生产γ-PGA的工业化步伐，为我国的氨基酸产业的发展开拓更为广阔的生存空间。