宏基因组技术在生物医药领域的应用探讨

胡 敏，曲丽娜，卞立红，任国领，张奕婷，王金龙

(大庆师范学院 生物工程学院，黑龙江 大庆 163712)

1 引言

宏基因组，最初于1998年由Handelsman等提出，指一个环境中全部微生物基因组信息，包含可培养的和不可培养的。宏基因组技术属于高效的组学技术。2004年Handelsman[1]发现宏基因组技术可以通过对微生物的细胞直接提取的方法获得。2010年Wong[1]发现宏基因组技术还可以用于研究基因群和酶编码基因，用于研究生物合成过程的生物活性催化剂和次生物代谢物产量，比如生物活性化合物。目前宏基因组技术已广泛应用于医药、农业、卫生、能源开发、生物技术、环境修复等方面。本文简述了宏基因组技术在生物医学领域的运用，包括药物开发、人体微生物群落的研究和疾病的诊断和治疗。

2 宏基因组基本技术

2.1 宏基因组 DNA 提取

常用的提取DNA的方法有直接裂解法和细胞提取法。直接裂解法可以通过物理途径和化学途径，可以利用超声波、冻融法、表面活性剂、盐和有机溶剂等对DNA进行提取。细胞提取法通常采用相应酶对细胞进行处理，达到细胞破碎的目的。两种方法各有利弊，其差异取决于细胞破壁方法。

2.2 宏基因组文库构建

提取后所得到的基因组DNA，经过纯化处理后进行酶切，之后将DNA片段与表达载体连接，转移到生命力旺盛的传代培养细胞中并进行培养。这个过程称为建库，即构建宏基因组文库[1]。宿主细胞对转移进去的表达载体进行转录翻译表达，根据基因功能筛选出所需要的宿主细胞。建立的宏基因组文库包含了所有的微生物DNA信息(包括可培养或不可培养)，有利于开发新型的生物活性物质。

2.3 目的基因的筛选

随着宏基因组技术的发展，其目的基因的筛选方法也增加了很多，但主要方法仍为功能筛选、序列筛选以及底物诱导基因表达等。序列筛选是利用PCR或探针直接对基因序列进行扩增或检测；功能性筛选是对基因的表达产物进行检测筛选，目前检测的基因功能有抗菌活性、酶活性以及溶血活性等；底物诱导基因表达的筛选方法是由于底物的存在，而引起目的基因的功能酶合成的检测方法，这种方法在筛选活性酶相关基因中被利用。宏基因组操作步骤如图1 。

图1 宏基因组技术操作步骤

3 宏基因组技术在生物医药领域的应用

3.1 宏基因组技术在药物开发方面的应用

宏基因组药物的开发大部分来源于微生物的次生代谢产物，特别是抗生素。在Doreen E等[2]的研究中，他们构建了包括24545个克隆的宏基因组文库，并对其进行筛选，选取了其中3个克隆(p57g4、p214d2、p89c8)，对其进行检测与分析，检测结果为妥布霉素和妥布霉素B，这两种抗生素的抗菌活性较广，具有广谱抗菌活性。美国KOSAN科技公司利用宏基因组技术发现了一系列的天然产品，包括多柔比星、红霉素、四环素、Rapamy cin和FK506。Rondon MR等[3]等进行了宏基因组文库的建立，并对其进行筛选，选择出了表达脂肪酶的克隆基因，发现其也具有抵抗细菌的功能。赵晶等[4]构建并筛选南极土壤宏基因组文库，得到具有抗肿瘤活性克隆子13株，运用MTT法对活性较高的克隆子进行测定，结果表明AE-3克隆子明显抑制卵巢癌细胞的生长。国外的一些实验室已经在研究宏基因组技术的非核糖体肽的生物合成，为生物药物的开发提供了一个新的想法。

3.2 宏基因组技术在人体微生物群落研究中的应用

一般来说，人的正常菌群在口腔、皮肤、呼吸道、尿道和胃肠道等处都有存在。正常菌群与人体健康密切相关。他们可以合成并帮助人体吸收一些必需氨基酸和维生素；处理人类饮食中一些难消化的成分，如植物多糖；占据人体不同的粘膜表面，产生天然抗生素，抑制有害菌的着落和生长等。目前已有许多关于传统方法对人类正常菌群进行研究，但需要纯粹的微生物培养，这限制了对生物体正常菌群的了解，尤其是对不可培养的微生物。宏基因组学克服了传统方法的局限性。它既可以研究微生物组成和数量，也可以了解微生物群落本身与微生物环境中寄主的进化关系、功能基因的分布及其对人类健康的影响。

3.2.1 在肠道微生物方面的研究

利用宏基因组技术对比研究了节段性回肠炎患者和正常人肠道中微生物多样性，发现患者肠道中微生物多样性显著降低，尤其硬壁菌门的细菌种类明显减少[5]，表明人体肠道微生物多样性与人体健康相互关联。科学家建立人与动物肠道微生物群宏基因组的对比，并对其代谢特征进行了分析。研究发现：细菌感染可能引起肥厚，肠道内的阴沟肠杆菌可能会导致肥胖；Ⅱ型糖尿病不只与糖代谢异常有关，也与菌群失调有关，肠道内某些种类的乳酸菌可能影响糖尿病的发生和发展[6]；在化疗患者中研究肠道菌群，发现化疗患者的肠道菌群可以通过损伤的肠道黏膜进入循环系统从而刺激免疫细胞的产生，协助杀伤肿瘤细胞，结果表明某些种类的肠道菌群可能导致肠癌的发生，但现在研究仍不能明确癌症与肠道菌群的因果关系[7]。在余佳文[8]研究中认为，人类和动物体内存在很多适合微生物生存的区域，例如肠道内、口腔以及皮肤表面，宏基因组学的方法可以用来研究这些区域中的微生物，特别是在疾病治疗上，可以用这种方法来实现对病人病情变化的观察和治疗过程中治疗计划的纠正，达到医治手段能够及时针对病症的作用。

3.2.2 在口腔微生物方面的研究

Ling等[9]通过研究无龋儿童和患龋儿童龈上菌斑群落结构，发现纤毛菌、链球菌、放线菌、毗邻贫养菌、硫单胞菌和韦荣菌组成的群落与龋病有显著的相关性，可以从未患龋个体的微生物群组中寻找有效的抗菌肽和益生菌作为新型的抗龋药物；Colombo等对牙周炎患者的进行研究，发现在顽固性和可治疗性牙周炎患者龈下菌斑的细菌种类比健康人多很多，且与健康人相比较还具有更多的牙周炎致病菌，表明牙周炎致病菌与慢性牙周炎相关；邓盟等[10]对口腔扁平细胞癌患者的唾液微生物组进行研究，获得了8门微生物，提示口腔癌伴随有口腔微生物组的结构的改变，并对口腔细菌群体中的耐药基因进行了分析，结果发现一个新的耐四环素基因tet32 ，其能够使四环素失活，口腔微生物组或许可以用于口腔癌的早期诊断。

3.3 宏基因组技术在疾病诊断与治疗方面的应用

随着医学技术的发展，越来越多的疾病得到攻克，但也有许多疾病还都没有找到病因，对于那些常规实验室检测不到病因的疾病被定义为未知病因疾病，这些疾病有较高的发病率和致死率，例如新生儿腹泻，每年造成180万人的致死，但至今没有找到明确的致病病原体。许多诸如流感样疾病、新生儿腹泻、阿尔茨海默病、各种形式肿瘤以及其它未知病因疾病都将受益于宏基因组学，这也将开启其在公共卫生和传染病防治领域的应用。

宏基因组技术可以对样本的DNA直接测序，减少了传统检测方法的时间和提高了准确性，快速找出致病病原体，为药物和疫苗的研发提供了时间和基础。菌血症常常发生在ICU，因其发展速度快、并发症多和死亡率高的特点，严重危害到了患者的生命安全，宏基因组技术可以快速找出致病原并进行有效的抗菌治疗。Long 等[17]对 78 例 ICU 患者的血浆分别进行宏基因组二代测序和血培养，结果显示，宏基因组二代测序方法的病原体检出率为 30.77%，而血培养法仅为 12.82%，表明宏基因组技术在病原体检测中具有更高的灵敏性。Abril 等[11]将 1 例脓毒症患者血浆中的游离细菌 DNA 进行宏基因组测序，24h内便检测出嗜二氧化碳噬细胞菌(Capnocytophaga canimorsus)基因序列高度富集，并使用 16s rRNA 测序进行确认，体现出宏基因组技术相对传统检测方法具有更高的效率。

传染性疾病的预防要比治疗显得重要的多，预防未知病毒对人类的传入是一项艰巨的任务，需要相匹配的病毒检测和鉴定技术。在过去的十年，我们见证了宏基因组学技术在各个领域病毒学研究中的强大作用，流行病学研究表明很可能会有新的病毒从植物传给人类，同时，我们也面临恐怖分子进行病毒袭击的危险，病毒宏基因组学技术以它快速灵敏的特点，将会在病毒检测中发挥传统培养技术及序列依赖方法所不能起的强大力量。尽管宏基因组学技术还不是常规诊断方法的一部分，但是宏基因组学与人体存在的微生物基因组联合使用，用于疾病预防以及诊断和治疗具有重要的意义。

4 宏基因组技术研究展望

虽然宏基因组技术具有广阔的应用前景，但也有局限性。如果DNA提取方法不能获得环境中所有微生物的全部基因组信息，就需要改进样品采集和检测操作。此外，宏基因组技术涉及到复杂的数据分析，这些数据分析属于生物信息学的范畴，因此必须将宏基因组学与生物信息学相结合，可以消除传统遗传算法的缺点，如：效率低、成本高和时间成本等。总之，随着检测手段和高通量测序技术的飞速发展，宏基因组技术的应用范围将会越来越广泛，为生态环境以及人类的生存创造更好的条件，有利于更加保证人类合理利用自然、与自然和平相处的幸福健康的生活。

宏基因组在生物医药领域的研究属于刚刚起步阶段，但研究前景令人看好。未来有望在以下方面取得突破并得到广泛的应用：不可培养的微生物耐药机制以及在传播中的作用；新型未知感染性疾病的诊断；特殊微生物群体致病机制的发现(例如生物膜)；女性阴道微生物群落的平衡与疾病的预防等。人类宏基因组的研究比较晚，应该充分发挥现有的优势，不断努力的深入研究克服阻碍，加快研究宏基因组在医药领域的进展。