基于Python的Crispr/Cas9 Oligos批量生成器

彭 景，许 杰，程 威,尹重超，陈恒玲

(中南民族大学 生物医学工程学院，湖北 武汉 430074)

1 引言

CRISPR/Cas系统是一种获得性免疫系统，最初被发现来源于细菌。它能识别并结合特定的DNA片段，cas9蛋白可以在其转录产物crRNA的介导下对靶基因进行剪切，实现对外源DNA的防御[1～3]。CRISPR/Cas的功能过程可以概括如下：得到CRISPR的间隔区序列、CRISPR基因座的表达、相关复合体对靶DNA进行剪切。精确有效的基因组编辑是基因功能鉴定的关键。到目前为止，CRISPR相关系统已成功地应用于动物和植物[4～7]。

在上述理论基础上，一种新颖高效的基因编辑技术应运而生，它是由Wiedenheft等设计出的，具体内容包括：设计出的sgRNA可以识别并结合Cas9蛋白，并介导cas9蛋白对靶基因进行剪辑(图1)，其中sgRNA是根据crRNA与tracrRNA的复合体设计出来的[2～4]。由细菌中复杂的CRISPR/Cas9系统精简为sgRNA与Cas9作用结构模式，使得只需要简单地将其导入到细胞便可实现对靶基因进行定点编辑，很大程度上提高了基因编辑效率。因为该技术具备高效性、低成本性和简易性等优点，所以生物研究界对CRISPR/Cas9系统十分关注，并应用到了更广阔的研究领域[1,3]。

图1 sgRNA指导的CRISPR/Cas9基因剪切系统(图片来源于《一种新型的构建CRISPR/Cas9 KnockOut载体的方法》)

Cas9可以被引导到一个与sgRNA互补的20 mer基因组位点，介导DNA双链断裂。5’-NGG原引物邻近基序(PAM)必须位于目标序列的邻近位置[8,9]。为了选择合理的目标位置和最小化偏离目标的影响，已经建立了一些优化sgRNA选择的计算工具。在获得sgRNA序列的基础上，普遍采用的Zhang Lab寡核苷酸序列设计的方法(图2)来设计oligo的生成(概括起来就是:在设计oligo时，首先要保证模板序列的开头为G，以确保稳定性。oligo1是在上述序列基础上在其5’端加上CACC形成的，而oligo2则是在碱基配对所得的反转序列的5’端加上AAAC形成的)[4,5]。然而，从sgRNA生成oligo非常需要有效的计算工具。在当前的分析中，创建了一个基于Python的Crispr/cas9 oligos生成器的本地应用程序工具，允许用户批量地在输入sgRNA序列中设计oligos。Crispr/cas9 oligos生成器可以免费下载。该软件是专门设计用于引物序列变换的工具，能有效解决人工自反转问题，很大程度地提高设计精度，节省时间。

图2 oligo序列设计示意图(图片来源于 zhanglabcloningprotocol引用张锋的文章)

2 软件开发及功能介绍

2.1 开发工具及开发环境

由于python语言的简洁、易懂、易开发等特点，十分适合用来编写本课题的生成器[10,11]。Python内有常用于科学研究的科学数据包anaconda和数据库tkinter，这为本次程序编写提供了研究背景[13]，其中tkinter是tk的python接口，而tk原本是Tcl的graphical user interface(GUI)，就是图形界面用户接口，可以类比于许多编程语言涉及到的“控制台”的命令行化分的编辑模式[12,13]。因此，该软件是基于python环境下，以PyCharm为编辑代码工具，主要利用anaconda和tkinter开发完成的[15]。设计流程主要包括：软件前期的设想与准备、搭建操作平台、导入所需要的数据库和函数、编写功能函数、设计用户界面、软件的测试与改良。主要功能是检验靶序列是否正确，完成靶序列的转换和存储，最终获得oligo1和oligo2两个序列。

2.2 软件界面与功能介绍

2.2.1 软件界面

软件界面如图3所示。

图3 软件界面

图3中有5个功能框：引物名称、靶序列、+G、oligo1、oligo2，包含3个功能键：start、clear、save。其中引物名称、靶序列是必填项，+G、oligo1、oligo2是按start后自动生成的，

这个软件可以进行批量生产，最后可将所得到的数据保存成Excel格式。

2.2.2 软件功能

软件正常操作及结果如图4所示。

图4 软件功能实例

图4中所示为对3个引物：A18、G14、D3进行引物处理。start键的功能是检查序列是否符合规范，它能检查到每一位碱基是否符合规定，并且能精确到每一位，并对靶序列进行操作。只有当检查到序列满足要求时，才能进行下步操作，编辑出符合规定的+G、oligo1、oligo2序列，并显示在功能框中。clear键的功能是清除方框中的数据，并可以接着进行下一序列的设计。save键的功能是将运行后的结果选择存储位置，并将该数据以Excel格式进行保存。引物名称框需要用户输入靶序列的名称。靶序列框需要用户输入将要处理的靶序列。+G框内是可以判断靶序列的头端是否包含“G”，若包含“G”则不处理，若不包含，则需要在序列开头+G。oligo1框内功能是把+G后的靶序列前端加上“5-CACC”，在最后端加上“-3”。oligo2框内功能是在序列前端加上“5-AAAC”，然后连接对oligo1从3端按照碱基互补配对原则进行匹配的序列，最后在最后端加上“-3”。

2.2.3 序列结果保存

结果保存如图5所示。

图5 序列结果保存

上述操作的结果会按照规定的格式存储在表格中，用户可以自行选择存储路径，这样的结果简洁规范，不需要进行人工地核对，节省了时间提高了精确度。其结果文件方便发给引物公司，进行后续工作，加快了研究工作进度。

3 软件测试

3.1 序列判断出错程序介绍

因为编辑的序列只有20碱基，且只能包含“A、T、G、C”四个字母。当使用者在功能框输入序列信息，并点击相应功能按钮时，软件会对输入的序列进行检测。程序将首先检验输入序列的长度，序列长度若大于20或者小于20，将会弹出提示框，若长度刚好为20，程序将检验序列的字母，确保输入的序列只含有“A、T、G、C”，若输入正确，程序将会为输入序列进行相关操作并保存相应信息。若输入的为“A、T、G、C”以外的字母，程序将会出现提示对话框并要求用户重新输入正确的序列。下面提供了检测序列的函数(图6)。

图6 检测序列函数代码

3.2 对于序列写错的提示和警告框介绍

(1)靶序列出错，碱基没有按照要求填写，输入的序列不是满足只有“A、T、C、G”这四个字母含有其他的字母。如图7所示。

图7 检测序列错误

(2)靶序列至少有一行长度不符合长度不符合要求(即不满足20个碱基数)。如图8所示。

图8 检测长度错误

(3)在没有输入靶序列时，还进行操作出错。如图9所示。

图9 未输入靶序列错误

4 结论与展望

本课题组所研发的基于Python的Crispr/Cas9 oligos批量生成器顺利完成了测试，可以自动地以特定方式对靶序列进行添加和编辑，以生成符合要求的oligos序列。与手动编写相比，该软件不仅节约了科研人员的时间与精力，提高了工作效率，而且大大降低了错误率。如果可以继续推广这个软件，将加快相关科研工作的展开，更有利于Crispr/Cas技术的发展与应用。

尽管Crispr/Cas9 oligos批量生成器尚存在一些不足：比如读取序列文件功能还未实现、序列查错可以更加人性化以及可以添加更丰富的引物设计方案等。而且相信随着我们不断地完善，这款软件一定会变得更加人性化，功能也会更加强大，更快地成为科研工作者的友好工具。

基于Python的Crispr/Cas9 oligos批量生成器源代码可在GitHub和谷歌云盘上免费获得，上传网址分别为：https://github.com/scuec-channel/oligo-generator.git和https://drive.google.com/open?id=1nNRzZ9u0rTLbmiv2L-xG4eUHRK9ZLcQ8(The source code for the python-based Crispr/cas9 oligos batch generator is freely available on GitHub and Google cloud disk,Upload url:https://github.com/scuec-channel/oligo-generator.git and https://drive.google.com/open?id=1nNRzZ9u0rTLbmiv2L-xG4eUHRK9ZLcQ8)。