固相萃取-高效液相色谱法测定地表水中苯胺类

刘 畅

(辽宁省生态环境监测中心，辽宁 沈阳 110161)

1 引言

苯胺类化合物是重要的工业原料，具有致癌、致畸、致突变性，可通过呼吸道、消化道进入人体，亦可经皮肤吸收。我国环境优先污染物黑名单已将苯胺、二硝基苯胺、对硝基苯胺、2,6-二硝基苯胺等列入其中。在我国的标准体系中，《地表水环境质量标准》(GB 3838-2002)中关于生活饮用水地表水源中苯胺的限值为100 μg/L。由于苯胺类化合物很难被生物降解，易在环境中造成累积污染，因此，为了有效掌握并控制地表水体中苯胺类的污染状况、确保公众用水安全，开发地表水中简单实用且灵敏度较高的检测方法具有重要意义[1]。

本研究建立了经样品前处理，可同时检测生活饮用水及其水源水中苯胺、对硝基苯胺、2,4-二硝基苯胺、3,5-二硝基苯胺、2,6-二氯-4-硝基苯胺5种苯胺类化合物的固相萃取-高效液相色谱检测方法，实现苯胺类化合物较为快速、简便的分析。

2 材料与方法

2.1 适用范围

本方法规定了测定地表水中5种苯胺类化合物的固相萃取-高效液相色谱法。

本方法适用于生活饮用水及其水源水中苯胺、对硝基苯胺、2,4-二硝基苯胺、3,5-二硝基苯胺、2,6-二氯-4-硝基苯胺的测定。

本方法检出限为：苯胺类0.5 μg/L。

2.2 原理

样品经过滤后，通过固相萃取技术富集水样中苯胺类，洗脱液浓缩定容后，用高效液相色谱仪(二极管阵列检测器)进行分离检测。固相萃取是一种物理萃取过程，包括液相和固相，固相对苯胺类化合物的吸附力大于样品母液；当样品通过固相萃取柱时，苯胺类被吸附在固体表面，其他组分则随样品母液通过固相萃取柱；最后用洗脱液将苯胺类洗脱下来，用高效液相色谱仪检测分析，根据保留时间和特征吸收谱图定性，外标法定量。

2.3 试剂及药品

样品分析、标准样品配置所使用的试剂除均为色谱纯或优级纯(有特殊规定的除外)。

甲醇：每批甲醇都要进行空白检验，液相色谱纯；去离子水：超纯水仪制备，满足电阻率≥18.2 MΩ/cm，TOC<5 μg/L，不含目标化合物；苯胺类标准储备液及使用液：苯胺类标准储备液100mg/L，可直接购买有证标准溶液，按照产品说明书要求保存，也可用标准物质配置，标准物质纯度要大于99.0%，用甲醇作溶剂，-10 ℃及以下冷冻、避光保存；苯胺类标准使用液1.00 mg/L，取适量储备液，甲醇作溶剂进行稀释，-10 ℃及以下冷冻、避光保存，保质期一个月；固相萃取柱：MCX固相萃取柱(500 mg，6 mL)或其他等效固相萃取柱；滤膜：0.45 μm聚四氟乙烯滤膜；硫代硫酸钠：优级纯；盐酸：1.19 g/mL，优级纯；甲酸：液相色谱纯；氨水：0.91 g/mL，优级纯；氮气：纯度≥99.99%。

2.4 仪器设备、器皿

高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器；色谱柱：HSS T3 液相色谱柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)或等效色谱柱；固相萃取仪：自动或手动(带真空泵)，流速可调；自动浓缩仪：氮吹浓缩仪或其他性能相当的设备；各种规格的微量注射器或移液器。

2.5 样品的采集、保存

将水样采集于棕色的磨口玻璃瓶中，样品瓶要确保充满、无气泡，不留空隙。完成样品采集后，用氨水和甲酸将样品pH值调节至7～8之间，同时，加入硫代硫酸钠(加入量：40 mg/500 mL)。水样中的苯胺类易于降解，需在4 ℃及以下冷藏且避光条件下保存，尽快分析。采样后应在24h内进行萃取，且萃取后需在7 d内进行分析[2]。

2.6 分析步骤

2.6.1 前处理

取水样1000 mL，经0.45 μm滤膜减压过滤，滤液过MCX固相萃取柱。固相萃取柱使用之前以10 mL甲醇和10 mL去离子水进行活化。控制水样以5～10 mL/min的流速通过固相萃取柱，从而进行富集浓缩。上样过程完成后，分别用10 mL 0.1 mol/L 盐酸和10%甲醇水溶液清洗以净化样品，用氮气吹干固相萃取柱后，用10 mL 2%氨水甲醇溶液以1 mL/min的流速将固相萃取柱中的组分洗脱下来，洗脱液收集于浓缩瓶内，氮吹浓缩至1.0 mL以下，用20%甲醇水溶液定容至1.0 mL，并经针头过滤器过滤，保存待测定[3]。

2.6.2 空白样品

空白样品实验过程即用实验室用去离子水代替实际样品，严格按照2.6.1节规定的步骤进行空白样品制备。

2.6.3 液相色谱分析条件(推荐)

色谱柱：HSS T3液相色谱柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)。 流动相：梯度洗脱；V甲醇∶V水(含0.2%乙酸)=35∶65(V/V)，保持15 min，后以线性变化至甲醇∶水=60∶40(V/V)，并保持15 min。 检测器：配有二极管阵列检测器(扫描范围：200～400 nm)，定量波长254 nm或230 nm。 进样体积：10 μL。 流 速：0.8 mL/min。 色谱柱温：30 ℃。 依据保留时间和检测物质特征吸收谱图进行定性分析，使用外标法峰面积进行定量计算。

2.6.4 标准曲线的绘制

取100 mg/L苯胺类标准储备溶液用甲醇稀释至6个质量浓度(至少5个质量浓度)：1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L和50.0 mg/L。在推荐的液相色谱分析条件下，对系列标准溶液进行测定，由低浓度到高浓度依次进样，以苯胺类含量(mg/L)对峰面积(μV·s)绘制标准曲线，回归方程线性良好，相关系数为0.999。

2.6.5 样品的测定

在推荐的液相色谱分析条件下，按照2.6.4节中的要求进行样品的测定。

2.6.6 空白样品的测定

在推荐的液相色谱分析条件下，按照2.6.5节中的要求进行空白样品的测定。

2.7 精密度和准确度

分别取质量浓度为1.0 mg/L和10.0 mg/L的苯胺类溶液进行6次平行测定，其相对标准偏差为2.4%～8.1%。添加以上浓度水平的水样进行回收率实验，回收率为72.2%～96.1%。

3 质量保证和质量控制

3.1 空白样品的测定

每批次(≤20个样品/批)或每20个样品至少应进行一个实验室空白样品的测定，空白样品的测定结果应低于方法的检出限。

3.2 平行样品

每批次(≤20个样品/批)或每20个样品至少应进行一个平行样品的测定，平行样品测定结果的相对偏差应控制在25%以内。

3.3 校准

要针对每批样品建立标准曲线，标准曲线的相关系数应≥0.995。每批次(≤20个样品/批)或每20个样品应对标准曲线中间浓度点标准溶液进行一次测定，中间浓度点标准溶液的测定结果与该点浓度相对误差需控制在±20%之内。

4 结果与讨论

4.1 色谱柱的选择

苯胺类化合物一般采用C18柱分析。通过实验对比C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)和HSS T3柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)对目标化合物的分离效果，结果表明：C18柱对2,4-二硝基苯胺、3,5-二硝基苯胺未能实现完全分离，而HSS T3柱对5种苯胺类化合物均实现了较好分离[4]。

4.2 流动相的优化

通过实验对比等度淋洗和梯度淋洗对目标化合物的分离效果，为了达到5种苯胺类化合物均良好分离且整体出峰时间合理，需采用梯度淋洗方式。由于最先出峰的3种苯胺类化合物极性较为相近，需要采用低比例的有机相才能实现完全分离，若采用等度淋洗，则会导致后面两种苯胺类化合物无法被洗脱。经多次实验，V甲醇∶V水=35∶65(V/V)，保持15 min，后以线性变化至甲醇∶水=60∶40(V/V)，并保持15 min，可实现5种苯胺类化合物的良好分离[5]。

苯胺类化合物呈弱碱性，流动相若为甲醇-水，形成的色谱峰较宽，有拖尾现象。实验通过在流动相的水相中分别添加0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%(V/V)的甲酸，使流动相呈酸性，抑制键合相表面的未烷基化硅醇羟基的电离趋势，从而降低二次作用的强度，来考察流动相对目标化合物的分离效果。结果显示，甲酸的加入，对峰形有显著改善，随着甲酸配比的增加，峰形随之变尖锐，分离度同步提高。甲酸浓度提高至0.02%(V/V)时，分离度改善显著，因此选用水相中加入0.02%甲酸组成流动相[6]。

5 注意事项

(1)方法采用的固相萃取柱为MCX柱，此类固相萃取柱主要对弱碱性化合物有较好的萃取效果，若选用其他等效固相萃取柱，萃取柱的活化和洗脱等条件要做对应改变。

(2)样品浓缩过程中，要控制好浓缩速度，不宜过快，切记不要吹干，以免造成苯胺类物质的大量损失。

(3)由于苯胺类物质的毒性较高，在样品前处理、标准样品配置等过程中应佩戴防护器具，在通风橱中操作，避免试剂和样品接触皮肤和衣物。

(4)实验过程中产生的固体废物务必严格做到统一收集、分类管控，委托有处理资质的机构定期转运、处置。

6 干扰和消除

(1)当样品受到基质干扰影响测定结果时，通过对样品进行预处理、减少进样体量(稀释样品或减少进样体积)、优化实验过程条件等方式减少或消除干扰。

(2)当样品存在同分异构体干扰影响测定结果时，可通过优化高效液相色谱的梯度淋洗条件(淋洗液流速、柱温箱温度、淋洗液配比等)改善分离度，进而减少或消除干扰。

(3)当样品受到余氯等氧化性较强的物质干扰影响测定结果时，可通过在样品的采集、保存过程加入一定量的硫代硫酸钠消除干扰。

7 结语

本文利用固相萃取-高效液相色谱开发了一种同时测定生活饮用水及其水源水中5种苯胺类化合物的检测方法，方法在1.0 mg/L～50.0 mg/L范围内线性良好，方法检出限为苯胺类化合物0.5 μg/L，回收率为72.2%～96.1%。同时，尝试对色谱柱进行优选并对流动相的配比和梯度淋洗程序进行改进，通过实验发现，C18色谱柱对2,4-二硝基苯胺、3,5-二硝基苯胺未能完全分离，HSS T3柱对5种苯胺类化合物均实现了较好分离；综合考虑苯胺类化合物的出峰间隔和试剂成本，对流动相的配比和梯度淋洗程序进行了优化，在流动相中加入0.02%甲酸，有效改善苯胺类化合物峰型及分离效果。改良后，方法操作简单、灵敏度较高，具有较好的精密度和准确度，能很好地满足生活饮用水及其水源中苯胺类化合物的日常检测要求[7～10]。