石油降解菌筛选及应用研究

鄢雨朦

(辽宁大学 环境学院，辽宁 沈阳 110031)

1 引言

在石油生产运输和使用过程中，由于操作不当或意外事故导致石油泄漏，会对环境造成严重污染。近年来受石油污染的土地面积不断扩大，污染程度也日益严重。由于石油的主要成分有烷烃、苯、甲苯、二甲苯等多种复杂芳香烃，这些物质毒性大，有的有致癌致突变作用，进入土壤后难以去除，而且会随着径流进入周围的流域、地下水、油田及周围的生态环境中，带来了严重的环境问题[1]。有害的石油污染物经食物链富集在人体内，还会对人体造成严重的损伤[2]。

石油造成的土壤污染通常采用物理和化学方法去除，前者通过焚烧而破坏大部分有机污染物，这种方法费用高，不利于处理；后者采用化学浸提，效果较好，但因易造成二次污染而受到限制[3]。为治理石油污染的土壤，石油降解菌的发现，为石油污染的治理提供了新思路新方法。石油污染的生物修复技术由于生产费用低、不产生二次污染而被视为一项具有广阔前景的高新技术。

2 实验材料

(1)石油无机盐培养基：K2HPO46 g，KH2PO46 g，(NH4)2SO46 g，NaCl 5 g，石油1 g，pH值为7.0，蒸馏水1000 mL。固体培养基在此基础上加入琼脂15～20 g即可。

(2)牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1000 mL，pH值为7. 0～7.2，121 ℃灭菌20 min。固体培养基在此基础上加入琼脂15～20 g即可。

3 菌株的筛选、鉴定及应用

3.1 菌株的筛选

在被石油污染的土壤环境中采集土样，称取土样10 g，放入盛有90 mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，在室温条件下，以180 r/min的速度震荡20 h，震荡后静置。待出现固液明显界面后，取土壤悬浊液用梯度稀释法进行10-1、10-2、10-3梯度浓度稀释[4]。分别取不同浓度梯度的上清液加入到含有石油的石油无机盐培养基中进行富集，在37 ℃、120 r/min的恒温振荡器中培养7 d，循环3次。

采用平板划线法进行分离，将在石油无机盐培养基中富集后的菌株，分别用接种环蘸取少量液体在油平板培养基上依次划线，在37 ℃恒温培养箱中培养48 h，能在石油平板上长出来的则是石油降解菌[5]，共得到6株菌，编号为1#～6#。

取各菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 ℃、160 r/min恒温振荡器中培养24 h，按体积百分比5%的接种量接种到100 mL浓度为1 g/L的石油无机盐培养基中，37 ℃、160 r/min恒温振荡器中培养5 d，设置空白对照。最终发现6株菌降解效果有明显差异，其中肉眼观察接种菌株2#的培养基中石油呈絮状、不粘于瓶壁，一部分漂浮在培养基液体表面上，一部分存留培养基内使溶液悬浊，区别于接种其它株菌的培养基，故选用2#菌株进行后续实验。

3.2 菌株的鉴定

3.2.1 菌株2#的形态与特征

对筛选出的菌种进行形态学观察并进行生理生化实验[6]。菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，有光泽，淡黄色半透明。显微镜下观察菌体为球状，革兰氏染色结果为阳性。菌株有排油效果，能分解葡萄糖产酸，具有过氧化氢酶性，对淀粉起水解作用。

3.2.2 16SrDNA测序

16SrDNA测序由生工生物(上海)股份有限公司完成，测序结果在Gen Bank上与已知种属的16SrDNA进行BLAST，对获得的同源序列进行分析并构建进化树。系统进化树如图1所示，参照《常见细菌系统鉴定手册》[7]和《伯杰细菌鉴定手册》[8]，对菌株2#进行16SrDNA测序，然后进行同源性比较，结果发现与阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的16SrDNA序列的同源性为99%。因此结合生理生化指标可得，菌株2#归属于阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。

图1 菌株的进化树

3.3 菌株降解石油的应用

称取1 g石油溶于100 mL石油醚中，作为基准用油；分别稀释至0.2、0.1、0.02、0.01、0.001、0.002 g/L，用紫外分光光度计测定其吸光度[9]，作出原油浓度—吸光度标准曲线，得到回归方程为y=0.019x+0.0322。

按体积百分比，分别投加1%、3%、5%、7%、10%的阴沟肠杆菌到100 mL石油浓度为1 g/L的无机盐培养基中，设置空白对照，在35 ℃、160 r/min恒温振荡器中培养5 d。肉眼可见接种菌株的培养基中的石油呈絮状，一部分絮状石油漂浮在培养基液体表面，还有一部分留在培养基内部使溶液呈悬浊状态，与空白对照有明显差别。以石油醚为参比液测定吸收值，将测得的吸收值在标准曲线上对照查得含油量，计算菌株2#的石油降解率。不同菌株接种量降解石油的效果也不同，结果如图2所示。

图2 菌株投加量与石油降解率关系

由图2可见，实验得到的菌株2#对石油具有明显的降解作用，菌株投加量为1%(体积百分比)时降解效果最好，培养5 d后降解率可达到26.41%。

4 结语

从石油污染土壤中分离到一株石油降解菌2#，经16SrDNA测序鉴定为阴沟肠杆菌属，该菌能将石油作为唯一碳源进行代谢活动。采用该菌降解石油，菌株投加量为1%时能够达到最佳降解条件，将此菌株应用于石油污染的治理中，菌体在降解石油后，其菌体本身可通过自然降解而去除，不仅可用于处理被石油污染的环境，还不会对环境产生二次污染。这些结果为进一步采用该菌修复石油污染的土壤奠定了基础。