粪大肠茵群监测分析中存在的问题探讨

鲁朝旭 袁妁 陈巧 李晓曼 梁时军

摘要：指出了近几年来。我国在粪大肠茵群的监测方面取得了很大进步，粪大肠茵群的相关环境标准也在不断地更新。但在监测分析中仍然存在一系列的问题.对样品采集、保存与运输、实验室分析、质量控制、仪器设备、环境条件、人员技术水平以及样品分析后废物处理全过程进行了探讨，并对存在的问题进行了分析，提出了解决办法和建议，以期为粪大肠茵群项目的监测工作提供参考。

关键词：粪大肠茵群;监测;问题探讨;建议

中图分类号：X832 文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2019）14-0178-04

1引言

粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，用来表明水质受污染的程度，主要来自粪便。粪大肠菌群是一类能使乳糖发酵、产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在44.5℃培养24～48h能发酵乳糖产酸产气。通过对粪大肠菌群的监测，可了解水体受生活污水污染的状况。粪大肠菌群适用于河流、湖泊等地表水、企业污水及医院废水的监测，是综合评价城镇污水尤其是生活污水污染的一个必不可少的重要指标。

粪大肠菌群作为地表水环境质量标准唯一的一项微生物监测指标，我国多用多管发酵法进行检测，近几年也更新了好几个相关环境标准。由于样品中粪大肠菌群项目监测的特殊性，样品的采集和保存、实验室分析、仪器设备、试剂质量、操作方法、环境条件、人员技术水平等各个环节都会影响实验结果的准确性。本文探讨了粪大肠菌群监测中存在的问题，并结合自身监测经验提出了建议，以供各位同仁参考和探讨。

2样品的采集和保存

2.1采样瓶的准备和存放

采集粪大肠菌群的采样瓶需要用牛皮纸封包好后，再经过高压灭菌器灭菌才能使用。灭菌后的采样瓶里如果含有少量冷凝水，可以放在烘箱里烘干。有条件的单位，也可以使用无菌采样瓶。灭菌后的采样瓶也有其保存期，超过两周内未使用就必须重新灭菌。绝大部分实验室都是在首次灭菌后不再管其使用期限。采样瓶存放过久可能受到杂茵污染。

2.2样品采集

采样人员大多缺乏细菌学监测知识，出现很多采样不规范的现象。如：微生物项目水样和理化水样混采;灭菌瓶开盖时间过早、水样在空气中暴露时间过长;水样采集量过满（既容易导致水样中细菌缺氧死亡，又不利于水样检测前振荡摇匀）;微生物样品和其他理化项目同时采样时，没有做到细菌样品优先采集;采样人员在采集样品时，没注意避免采样瓶受杂菌污染（手接触到瓶盖和瓶颈、采样设备不规范）。

采样人员要岗前培训，获得上岗证后参与采样丁作，采样人员一定要严格按照采样步骤以及质量保证和质量控制技术规范进行采样。主要注意以下几点：第一，细菌样品的采集在条件允许的情况下尽可能直接采样，或使用专用采样装置采样，并坚持细菌样品优先采集的原则。第二，在采样前，特别是采集企业污水和医疗废水需要采样人员事先了解样品中是杏含有活性氯，采样瓶是否选择采用加有硫代硫酸钠溶液的灭菌瓶。硫代硫酸钠溶液需要临用现配，不能长时间保存。每125mL水样加入0.1mL硫代硫酸钠。第三，对于悬浮物比较多的样品，样品可以采取沉降30min的处理方式。第四，采样人员采样时需要用pH试纸测水样大致的pH值，以供后续分析人员选择合适的分析方法。

2.3样品运输保存

在样品的运输和保存过程中，样品的冷藏是关键（温度过高过低都不利于样品的保存）。由于仪器设备条件不够，运输过程不满足样品所需温度或者路途遥远，送检时间超过6h，都会导致样品失效。样品交接时间过长（在样品送人实验室之后，采样人员要将采样记录移交给业务室，然后由接样员对水样进行编号并将检测任务下发到监测室），导致样品没有及时分析而超过时限。特别是。在执法监测和污染源监督性监测中，需要的采样时间长，有时还需要分时间段监测，这过程很容易造成样品超时。并且，样品保存时间越长越不能保证样品在合格的冷藏温度下。这几年，经常出现企业和监测机构因该项目实验的特殊性发生纠纷。

建议在采集细菌样时，车上安装车载冰箱、冷藏箱或者其他冷藏设备，可以实时监测温度。加入冰块保存时，样品不可以直接接触冰块。不能保证样品在有效期内送达实验室分析时，可以考虑使用刚刚出台的酶底物法（HJ1001-2018）进行现场检验。该法对环境条件要求不高，不必在无菌室使用，在操作过程中避免微生物污染即可;操作简单，无需专门配置培养基，对操作人员专业水平要求不高;检测时间短，手工操作时间少于10 s，不需要通过实验确认;检测结果精确，假阳性和假阴性率低，全过程污染风险低。

3实验室分析

3.1试剂质量

3.1.1无菌水

目前很多实验室采用先配置所需量的稀释水到试管中再统一灭菌。在实验分析时发现由于稀释水在高压灭菌和冰箱存放这一系列过程中挥发，导致稀释水在做样时达不到所需的量。

建议先用大容量玻璃瓶统一准备足量的无菌水和100mL的量筒，使用时在无菌环境下按所需量进行分装。无菌水的配制尽量在当天或实验前一天配置，最好实验当天进行配制。无菌水需要调pH值、可在常温保存。

3.1.2培养基

培养基的质量是整个实验检测结果的保障，是实验室质量控制的重要环节。分析人员可能认为只要培养基在保质期内，都是合格的，而忽略了对培养基进行质量控制。

培养基需在湿度低、温度不超过30℃的房间避光保存，避免杂菌侵入。配置前，应该观察培养基颜色和体积，变化明显时废弃不用。配好的培养基需要在2 h內进行高压灭菌;对于不能及时灭菌的培养基，可以在冰箱内存放且不超过一天，因为灭菌不及时，就会影响其杀菌效果和营养成份的含量。培养基灭菌结束后应迅速冷却，避免长时间保存在灭菌锅内，容易造成灭菌过度从而影响培养基的营养成分。配置的培养基不宜存放过久，坚持多配少量的原则，尽量在一周内用完为好。每批培养基在使用前，都应对培养基进行质量鉴定，只有经过验证合格的培养基，才能投入使用。

特别注意的是，酶底物法测粪大肠菌群时，所用的培养基是厂家配好的，需要做的第一步就是表观验收，如：观察包装是否完善、颜色是否变色、重量是否达标。并记录好培养基批号、入库日期、开启日期等，保留好生产厂商提供的培养基质量测试报告。第二步是培养基的质量检验，如：实际样品测试、使用有证标准菌株进行培养基质量检验。这种培养基主要的储存方式是用自封袋或者密封盒密封好再放在冰箱，冷藏保存，避免潮湿。

3.2操作方法

3.2.1稀释倍数

有时候，企业污水、医疗废水等粪大肠菌群污染严重的水样需要稀释到10^-4～10^-5ug/mL之后接种，但分析人员不能准确判断其大致稀释倍数，容易出现超出或者低于定量范围。现行的环境监测分析方法与有关技术规范中粪大肠菌群检数表里所列的几个不定值（“<”或“>”）给监测工作带来一定的困难。能否选择出正确的稀释度是实验成败的关键。

接种的稀释比，为了避免在实测数据中出现不定值，实验分析人员应充分了解自己所做区域各种水样的稀释比，根据待检水样的环境因素和水样性质确定合适的稀释比.。采样人员尽量将样品性质、受污染程度在采样记录上描述清楚，以供分析人员选择合适的分析方法。对于不确定稀释范围的水样，可以进行多种梯度稀释。

3.2.2结果判读

在使用多管发酵法测试时，如果在初发酵试验中未发现产气，可以适当地延长培养时间到48h。

在使用酶底物法测试时，在培养24h后结果为可疑阳性或者无颜色反应，可适当延长培养时间到28h进行结果判读，超过28h之后出現的颜色反应不作为阳性结果。如果样品有背景颜色，需做一个空白试验，与标准盘作比较。如果加入培养基，样品颜色过深，可能是余氯过多或者pH值过低的原因，这种方法就不适用了。

4质量控制

4.1质控措施

粪大肠菌群项目的监测起步比较早，但是之前一直作为非标项目，粪大肠菌群的质控标准菌株也是在近两年才兴起。大部分实验室分析人员之前没有接触过质控，也没有接受过这方面知识的培训，在近两年密码样考核和实验室间比对中，该项目的效果不是很好。目前国内使用的有证标准菌株几乎都是从国外购买的，价格贵、购买渠道复杂且不易保存。国内实验室很少有达到对每批样品使用有证标准菌株进行阳性、阴性对照试验。微生物的质控、盲样制作难度较大，影响了国内实验室关于微生物方面质量控制的开展。

粪大肠菌群质控措施的发展和应用还需要政府相关机构、科研单位、企业共同的努力，建立一套准确、简单、成本低的检测措施，提高其实用性。尽管如此，各个实验室也应该尽量做到，定期使用有证标准样品进行质量控制，使用有证标准菌株进行阴阳性对照试验。酶底物法要求，每年至少必须进行6次定量试验、4次定性试验。

4.2空白和平行性

以前使用的多管发酵法、滤膜法等对空白和平行性没有明确的要求。大部分实验室也仅限于对每批样进行空白测定。

无论用哪种方法检测，建议每个月要对实验室用水做质量检测，每批样品要用无菌水做全程序空白和实验室空白测定，确保检测结果的准确性和可靠性。使用酶底物法分析时，对20个样品或每批次样品测定一个平行双样。

5仪器设备

主要的设备需要有使用记录，这既是实验室规范要求，又是型个实验过程真实性和完整性的最好证明，也是实验人员自我保护的一种措施。校准鉴定仪器设备的证书附在使用记录后，方便随时翻阅。

5.1灭菌设备

在日常工作中，分析人员侧重于样品的分析和专业技术的提升，往往忽视了有关压力蒸汽灭菌器在使用上的一些细节问题，存在灭菌质量隐患。最常见的是忽视了对校准过的培养箱进行日常监控管理。对69家实验室调查发现，在日常工作中不到8家实验室展开过对灭菌设备效果的检查。

对于有条件的监测机构，可以配备专门的灭菌设备室，而且应该有几台灭菌器。多个压力蒸汽灭菌器应该放置于不同的房间，或者在同一房间保持适当的距离，以免发生意外。灭菌器的放置位置注意远离火源报警器和其他电子设备。对废弃物、培养基、采样瓶等都需要单独灭菌处理，避免交叉污染。粪大肠菌群监测过程中各个环节，都不建议采用干热灭菌法，该灭菌法容易存在安全隐患。多用湿热灭菌，灭菌效果更好更安全。对灭菌设备效果的检查主要有以下几步：第一，每次灭菌都需要采用化学或物理检测法。建议使用高压蒸汽高温灭菌指示胶带和指示卡，检测时放于测试包或待灭菌包内中心，如变色不均匀或不彻底会提示未达到灭菌条件。第二，每月使用一次生物指示法。采用孢子悬浮液或孢子试条，如嗜热脂肪杆菌芽孢菌片进行灭菌效果检测。指示物应放在不易达到灭菌的部位。这是压力蒸汽灭菌器的灭菌效果中最准确，最直接的方法。第三，每年必须要定期鉴定灭菌设备。

5.2培养箱

据有关调查发现，69家实验室中，仅有5家实验室的培养箱房内安装了空调。几乎没有实验室对培养箱的温度进行实时监控。培养箱温度的均匀性是否符合要求，设备是否稳定等都对实验结果有重要影响。培养箱每年需要定期鉴定，但由于温度湿度四季在不断变化，培养箱放置的房间温度应比培养箱使用温度低，并在使用时内部放置一个精确的自动记录温度仪监控实验温度变化，设置报警上下线，设备运行报表下载。没有条件的实验室，可在培养箱里放置一根鉴定过的温度计监测温度变化。

针对稳定性采取的措施：建议实验室将培养箱置于同一个房间内，便于对设备进行监控和管理，培养箱的存放温度为16～27℃，无需存放在无菌室。仪器鉴定时要对关键温度进行特别鉴定，如：37℃、44.5℃。

培养箱温度的均匀性对多管发酵法的影响比较大，对酶底物法影响相对小些。目前市面上主要有三类培养箱：水浴培养箱、空气传温的培养箱和进口的培养箱。尽量采用水浴式或者进口的，效果更好。

5.3冰箱

试剂样品、菌种和质控样等对温度的要求高，大部分都是零下10℃以下才能保证微生物活性、不确定度和稳定性。因此，在冰箱内部放置自动记录温度仪，实时在线监控温度情况，设置报警上下线，设备运行报表下载。

5.4紫外灯

据调查发现，大多数实验室的紫外灯可能用了几年甚至十几年，也没有更换过。这样的紫外灯，灭菌效果可能已经不明显了。

建议定期更换实验室的紫外灯;配置有防护罩的紫外灯箱，用于保护分析人员不受紫外线辐射。

6环境条件

目前，环境监测机构的分析人员在实验室环境卫生方面的意识还不够。分析人员自认为自己接触的样品都是地表水、地下水或者少量企业污水，实验室比较安全，没有细菌广泛传播的可能性。因此，在很大程度上忽视了自身实验室环境安全。还有一部分的原因在于，实验室本身条件不够，无法达到无菌环境要求。

第一，微生物实验室需要单独设立，配有准备室、缓冲室、消毒室、无菌室或超凈工作台、培养室等避免污染;第二，保证实验室整洁干净、通风良好;第三，实验室应配备：冰箱、灭菌设备、洗眼设备、生物安全柜、应急设备等;第四，进行实验之前，分析人员应使用紫外灯对无菌室进行消毒处理：打开紫外灯进行30min左右的消毒，然后进行无菌验证，在验证合格后才使用无菌室。实验室人员进出无菌室，必须更换衣服鞋子。

酶底物法不必达到微生物实验室无菌环境的条件，但也需要注意避开明显局部污染源，建议使用一次性手套、口罩、酒精灯等。

7人员技术水平

目前，在各个监测站的人员配置上，微生物相关专业科班出身的比较少，大部分来自化学和环境学相关专业。因此，多数分析人员在岗前接触微生物相关领域机会较少，而是通过培训合格之后在工作岗位上深入学习微生物相关领域。建议加强对分析人员的培训：第一，各个单位在日常学术交流活动中，可以就微生物学的有关基本知识和专业技术知识对全体人员进行专门讲解和培训，大家都能对该项目有所了解，有利于日常工作的开展。第二，定期安排分析人员参加有关该项目的培训和继续教育，如：所负责的工作及必需的设备操作、微生物检测技能和实验室生物安全、新的检测技术等。第三，通过参加内部的质量控制、所属区域或行业的质控菌株活动，从而积累更多的经验，提高专业技术水平。如：实验室比对活动和能力验证工作、上岗考核、盲样考核等。

8废物处理

微生物项目实验后，所有使用过的器皿和试剂药品都应该先灭菌再清洗干净，确保有害微生物不会对人身造成危害和环境污染。

采取酶底物法后，废弃物要使用灭菌袋灭菌后才能弃去。调查中发现，在69家实验室中，只有3家实验室使用过灭菌袋。灭菌完，还是要尽量做到干湿分离，然后放在合理的位置上。

9其他

微生物项目的分析人员在写各种记录时注意，一定要把收样时间、样品分析时间、仪器使用时间等精确到分钟，这是确保整个实验过程完整性和准确性的标志。因为微生物样品保存和分析时间要求短，可能收样时样品已经过期，分析人员要做好相关记录，确保接到样品的后续过程无差错，保护好自己。

10结语

粪大肠菌群监测操作方法简单，但对实验室环境条件和设备要求高，整个操作过程要避免微生物污染。样品从采集、保存与运输、试剂质量、操作方法、环境条件、质量控制、仪器设备、人员技术水平以及废物处理等各个环节都将对样品中粪大肠菌群检测的结果产生重要影响。因此，在监测过程中要重视细节，确保检测结果的可靠性和准确性。为保证检验质量，还需要加强培训、提高分析人员的监测能力、加强实验室质量控制。