现代月季组培技术育种研究进展

黄晓玲

(浙江农林大学 暨阳学院，浙江 诸暨 311800)

1 引言

现代月季(RosaChinensis)是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(RosaL.)植物，被称为花中皇后，是世界著名的四大切花之一。现代月季花色艳丽、香气宜人，被广泛应用于园林、庭院装饰，可作切花、花篮等，也是各类食品、化妆品的重要香料原料。目前世界各地栽培的月季，大多以中国月季为亲本，经长期不断地选育和反复杂交而成，但因月季基因组的复杂性和远缘杂交的不亲和性，加大了杂交育种的难度，而使组织培养成为月季较为有效的育种手段。

2 国内外现代月季育种的研究进展

由于月季花色丰富、应用广泛、育种关注度极高，所以致力于月季育种的工作人员也不在少数。法国以Gudin教授通过探究各种条件下花粉的育性、花粉和柱头的不亲和性等，开展了月季胚培养的研究工作。中国学者开始在月季资源收集、保护、育种等方面取得了阶段性的成绩，为干旱寒冷地区选育出多数露地栽培新品种。中国农科院培利用抗寒、抗旱性强的野生蔷薇类与现代月季杂交，培育出了耐低温、长势良好的优良品种。张启翔教授等从事月季抗黑斑病转基因育种研究并取得良好成果。迄今为止，蔷薇属中大量的种质资源还未开发利用，如果这些种质资源参与目前现代月季的育种，必将在育种界产生新突破。

3 现代月季组织培养研究进展

目前现代月季的繁殖技术仍沿袭了传统的扦插、嫁接、压条等方法，这些方法限制了月季的繁殖量，不能满足工厂化生产的需求。1980年Hasegawa 成功在MS培养基上建立了月季试管苗无性系，开辟了月季组培的先河，提高了月季的繁殖速度，且植株根系发达、生长健壮、苗木整齐，并且节省时间和土地面积，不受季节的限制，是批量繁殖生产月季商品苗的理想途径之一。

为了进行基因转化、突变育种、快速繁殖和品种保存，必须建立植株的再生系统。植株的再生一般经历从愈伤诱导、愈伤分化、胚状体成熟萌发或芽的发育、到植株再生、完整植株的移植等步骤。下面将从丛生芽诱导、愈伤诱导、体细胞胚状体和器官发生等方面阐述月季的组织培养研究进展。

3.1 丛生芽的诱导

1970年，Elliott首次在野蔷薇(Rosamultiflora) 上成功地进行了芽的繁殖和诱导幼苗生根。1976年，Zieslin等报道细胞分裂素有利于提高丛生芽的数量，但也增加了诱发花器官败育或退化的频率。不同种类的细胞分裂素对月季茎增殖的影响也不同，Marcelis等在添加相同浓度的细胞分裂素，研究结果表明，KT实际上对茎增殖没有多少影响；而BA、ZT 、ZR都可显著促进茎的重量和长度增加。

3.2 愈伤组织的诱导

1967 年Hill的实验证明在培养基中添加2, 4-D或添加NAA均能很快诱导出愈伤组织。该实验证明在培养基中添加 2, 4-D 或添加NAA均能很快诱导出愈伤组织。Lloyd等的实验表明月季愈伤组织的诱导与其品种的基因型有关。

3.3 体细胞胚状体的发生

体细胞胚状体发生体系的建立将有助于现代月季的试管苗快繁、冷藏保存、人工种子的生产和基因的转化操作等等。多年的研究证明体细胞胚状体的发生是现代月季微繁殖潜在的非常有效的方法。体细胞胚再生的基本培养基有MS、1/2MS、B5、SH 等。Kintzios 的实验证明在供试材料上使用NAA、BA 和GA3对诱导产生体细胞胚状体无效，CPA才是诱导体细胞胚状体的决定因素。以上结果表明月季的体细胞胚状体发生能力也因品种以及外植体的类型随激素类型和浓度不同而有所变化。

3.4 器官发生

现代月季的芽器官发生表现为两种类型：一类直接起源于外植体，不需经过愈伤组织阶段；而另一类需要经历愈伤阶段的过程。以现代月季离体叶、根和愈伤组织为外植体诱导不定芽，结果发现添加适当浓度的BAP 和NAA的培养基均能诱导不定芽发生，但随着继代次数的增加，不定芽发生能力降低，且继代12周后，终止产生不定芽。

4 影响现代月季组培的主要因素

随着现代月季组培技术的发展，不断有研究者探讨影响现代月季离体快速繁殖的因素，发现这些影响因素不是单一的，其中主要影响因素有外植体的选择与灭菌、组培各阶段中的培养基和培养条件选择等，本文对这几方面影响因素做了概述，为现代月季的工厂化生产提供依据。

4.1 外植体的选择与灭菌

很多研究都证明枝条中部的腋芽萌发较顶部和基部时间早，且中部的腋芽长势好，这可能与月季枝条不同部位的腋芽成熟程度及休眠状态不同等因素有关。中部的腋芽增殖系数高，其次是基部，再次是顶部。但Podwyszynska等的研究表明外植体以第2节位的腋芽最有利于增殖，沈国正等分别以茎段和顶芽为外植体，发现茎段增效果好于殖顶芽增殖。李青等采用当年生枝条的冬芽和腋芽为外植体进行比较，发现越冬芽成活率高，且萌动所需时间较短，主要原因是芽内积累了大量的营养物质，能很快萌发生长。于冰沁发现垂直接种、斜向上45°接种是最佳的接种方式，水平接种其次，反转接种的腋芽再生芽生长量明显低于前3种接种方式，这可能与枝条原有的生长极性有关。

现代月季外植体灭菌通常采用酒精、升汞、次氯酸钠溶液和新洁尔灭菌，灭菌时间的长短是影响灭菌效果的关键。消毒液浓度过大或处理时间过长的灭菌效果好，但易引起植物表面组织破坏，失去萌芽力。选择外植体的时间对灭菌的效果也有影响，大体表现为春秋两季较好。除特殊需要外，应尽量避免夏季和冬季启动组培繁殖。

4.2 培养基和激素的选择

现代月季组培的培养基大体分为启动培养基、继代培养基、生根培养基。影响现代月季组培的植物生长调节剂主要有细胞分裂素、生长素和赤霉素(GA3)3 种。细胞分裂素参与克服顶端优势的过程，因而能促进侧枝的萌发和生长，嫩芽的繁殖主要是细胞分裂素影响的结果。生长素最明显的作用是促进生长，但其促进作用因浓度而异，较低浓度促进生长，较高浓度抑制生长。

4.2.1 启动培养

培养基的成分直接影响外植体的萌动和分化。启动培养基一般以MS为基本培养基，细胞分裂素和生长素结合使用，较常使用的有6-BA、NAA、GA3。其中，6-BA的有效浓度为0.5～3.0 mg/L；NAA 的有效浓度为0.01～0.5 mg/L。实际上，使用不含激素的培养基，只要外植体没有污染，枝条的养分充足，新芽即可长出。

4.2.2 继代培养

继代培养受糖浓度、pH值、激素配比的影响。糖量加大、pH值降低会使月季继代苗分化率提高20%，同时可缩短继代周期，但糖浓度不可超过50 g/L，pH值不可低于5.5。适宜的激素种类和浓度配比是现代月季腋芽萌发和丛生芽增殖的关键。继代培养中常使用的激素有6-BA、NAA、IBA、GA3。6-BA的有效浓度为0.1～3.0 mg/L，NAA的有效浓度为0.005～2.0 mg/L，IBA的有效浓度为0.01～0.3 mg/L。低浓度的6-BA有利于不定芽的增殖，浓度过高则抑制不定芽增殖；合适浓度的NAA 有利于芽和叶生长，但浓度过高诱导产生大量愈伤组织，不利于侧芽的直接分化和生长。乙烯提高月季芽的增殖效果与浓度有关，以5 mg/L最佳，但乙烯不利于苗的长高。此外，培养瓶里的含水量、相对含水量、水汽压都会影响月季芽的增殖。

4.2.3 生根培养

多数试验采用的生根培养基为1/2MS。研究发现，MS培养基中盐浓度过高，特别是氮素含量过高会导致生根不适应，因此需减少无机盐用量。生根使用的激素主要为IBA、NAA、IAA 等生长素，其中IBA有效浓度为0.01～1.0 mg/L、NAA有效浓度为0.01～1.0 mg/L、IAA 使用较少；李正平在月季组织培养中使用ABT生根粉，促进生根浓度为0.5～10.0 mg/L，最佳浓度为0.5～2.0 mg/L。此外，在培养基中加入活性炭可以显著促进生根量和根的长势，添加浓度为0.2～0.3%，这可能与活性炭对有害酚类物质的吸附有关。

5 展望

尽管国内外在现代月季组培方面取得了一定进展，但现代月季的再生受基因型的影响很大，不同的品种在愈伤诱导、胚状体及芽器官等的发生方面差异很大，且只有少数的品种能获得相对高频率的再生植株。因此，仍需加强现代月季植株再生研究，通过探索组织的培养途径来加快现代月季的育种进度和提高种苗的繁殖速度，早日实现现代月季种苗工厂化生产以满足市场的需求。