绯寒樱细胞悬浮培养技术研究

王莉

（南昌大学 科学技术学院，江西 南昌 330029）

1 引言

绯寒樱（PrunuscampanulataMaxim.）为蔷薇科李属落叶小乔木，又名福建山樱花，其树形优美，早春着花，花色呈粉红至绯红色，颜色鲜艳，满树繁花高雅脱俗，令人心旷神怡，是优良的行道树和风景林树种。近年在福建、湖北、广东等地示范栽培，深受消费者的欢迎。但由于收集种子困难和扦插繁殖技术不成熟［1］，各种规格的苗木生产供不应求。目前，绯寒樱离体快繁技术已有少量报道［2，3］，但主要集中在丛生芽诱导和生根诱导的研究，国内尚无绯寒樱细胞悬浮培养研究的报导。本文采用绯寒樱嫩枝为外植体材料，诱导出绯寒樱愈伤组织，进一步建立起绯寒樱细胞悬浮培养体系，为加快绯寒樱组培技术奠定基础。

2 材料与方法

2.1 材料

供试材料为绯寒樱野生树的嫩枝［4］。

2.2 方法

2.2.1 无菌外植体的获得接种材料为当年抽生侧芽饱满的幼嫩茎段，在自来水下冲洗0.5h，然后在超净工作台上用1g／L的HgCl2溶液消毒6min，无菌水冲洗5次，70%的酒精浸泡30s，无菌水冲洗2遍，用灭菌滤纸将残留于外植体表面的水分吸干。接着将外植体放入经灭菌处理的瓶中，1%L汞水浸泡7min（为确保外植体得到全面彻底的灭菌，要将瓶子加以摇荡），然后用无菌水冲洗5遍以上，备用。

2.2.2 愈伤组织的诱导

在无菌条件下，借助显微镜将外植体顶端剥开，切取长约0.8cm、带生长点及叶原基的茎段，接种于1／2MS＋0.5 6－BA＋0.01NAAmg／L培养基上15d诱导出愈伤组织。于 MS＋1.0 6－BA＋0.5NAAmg／L培养基上继代培养，取继续培养25d的愈伤组织。

2.2.3 樱花细胞悬浮培养体系的建立

将分散性好、疏松的愈伤组织，接种在MS液体培养基中，每150mL的三角瓶中加入液体培养基40mL，为了研究几种常用植物激素对樱花细胞悬浮培养的影响，选取6－BA和NAA以及2，4－D等3种激素（因素），每个因素设3个水平进行激素的筛选（表1）。摇床转速为120r／min，温度25℃。每隔10d继代1次，连续培养4～5代后逐渐形成稳定的细胞系。每隔1d在倒置显微镜下观察细胞形态、分散程度并照相，进行细胞计数，以建立细胞数量生长曲线。

表1 悬浮培养激素浓度正交实验

2.2.4 细胞悬浮生长曲线的测定

取0.5g悬浮培养物，接入新鲜液体培养基中，进行振荡培养，每隔1d取样1次，共培养13d，连续做3次平行实验。

2.2.5 悬浮细胞数目的测定

用血球计数板法对悬浮细胞计数，每个结果为4次平行实验的平均值。细胞数按下面公式计算：1mL悬浮液中的总细胞数＝A／5×25×104×B（A为5个中方格总细胞数，B为稀释倍数）［5］。

3 结果与分析

3.1 不同激素配比对细胞悬浮培养的影响

在植物细胞培养的过程中激素的种类及配比都会对植物细胞的生长、发育、繁殖、分化和新陈代谢起重要调节控制作用。因此本研究选用了不同激素配比来进行实验，各种激素组合对悬浮培养物的生长状态如图1。

图1 不同激素配比对悬浮培养细胞增重的影响

随着生长调节物质浓度的增高，悬浮细胞生长量加大，颜色为淡黄色或黄色。当生长调节物质浓度增至1.5mg／L 6－BA＋3.0mg／L NAA＋1.5mg／L2，4－D时，悬浮细胞生长受到了明显的抑制，而且培养液浑浊。因此，生长调节物质组合以1.0mg／L 6－BA＋2.0mg／L NAA＋1.0mg／L2，4－D为宜，此条件下细胞悬浮液为白色混浊，有许多大颗粒，细胞多数成团，保持较旺盛的分裂能力，见图2。

图2 生长状态良好的悬浮培养物

3.2 不同起始密度对悬浮细胞生长的影响

培养瓶中的培养物密度过高过低都会阻碍培养物的继代培养，即悬浮细胞的生长具有群聚效应，细胞密度太低，悬浮细胞生长缓慢；细胞密度过高时，细胞生长速度过快，细胞液泡变大，悬浮细胞容易积累有害物质，不利于悬浮细胞系的建立。只有密度合适，才能促进细胞生长，利于培养物的分散，形成细微的细胞团颗粒，建成胚性细胞系效应［6］。因此应当添加适当的培养物于培养瓶内，当发现培养瓶中培养物密度过大时，应及时分装进行继代培养。同时还要及时淘汰一些大的组织块和黄褐色的坏死组织。

表2所示的是不同起始密度对悬浮细胞生长的影响。结果表明：悬浮培养细胞最佳起始密度为2.5×104个·mL－1，最适合悬浮细胞的培养。

表2 不同起始密度对悬浮细胞系生长的影响

3.3 培养时间对樱花悬浮细胞生长的影响

不同的培养时间对樱花细胞悬浮培养也会产生影响，樱花细胞在营养充足的情况下，开始快速地有丝分裂，细胞的数目随着时间的变化而变化。通过培养、观察、计数，得到其数目变化的结果见图3。

图3 培养时间对悬浮培养的影响

由图3可知，悬浮培养细胞生长曲线呈现抛物线型，2～6d生长缓慢，8～14d进入对数生长期，并趋于稳定，达到最大值1.673×106个／mL，14d以后呈现下降的趋势。因此最佳培养时间为14d，樱花细胞悬浮培养的继代周期为10～14d。

3.4 摇床转速对细胞悬浮培养的影响

培养愈伤组织的摇床转速对其增殖量也有影响。30、50、70、90、110r／min，随着转速的增加，悬浮培养细胞增殖量也逐渐增加，但当转速超过130r／min后，悬浮培养细胞增殖量开始下降，原因有待进一步研究。因此确定愈伤组织适宜进行悬浮培养的摇床转速为120r／min。

4 结语

利用樱花嫩茎为外植体进行愈伤组织的诱导，进而建立樱花细胞悬浮培养体系，试验结果表明：愈伤组织以 MS＋1.0mg／L 6－BA＋2.0mg／L NAA＋1.0mg／L2，4－D液体培养基为最佳培养条件，培养温度26℃，摇床转速120r／min，细胞悬浮培养细胞最佳起始密度为2.5×104个·mL－1，培养14d，细胞悬浮培养达到最佳值。本实验初步确定了樱花细胞悬浮培养的条件，试验后期细胞系的稳定性较差，可能是由于激素的配比影响，本研究将继续补充相关试验，以提高樱花细胞悬浮培养体系的稳定性，为樱花组织快繁的产业化和规模化发展提供可靠的技术服务平台。

［1］吕月良，陈 樟，施季森.福建山樱花研究现状、开发前景与育种策略［J］.南京林业大学学报：自然科学版，2006，30（1）：115～118.

［2］王光萍，黄敏仁.福建山樱花的组织培养及植株再生［J］.南京林业大学学报：自然科学版，2002，26（2）：73～75.

［3］吕月良，陈 璋，施季森，等.福建山樱花不定芽诱导和植株再生规模化繁殖试验［J］.南京林业大学学报：自然科学版，2006，30（3）：105～108.

［4］和凤美，朱永平，杨晓红，等.冬樱花愈伤组织诱导和抑制褐化初探［J］.中国农学通报，2010，26（12）：130～134.

［5］王艳红，龚束芳，车代弟.丰花月季愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养［J］.东北农业大学学报，2007，38（2）：161～165.

［6］吴春霞.植物细胞悬浮培养的影响因素［J］.安徽农业科学，2009，37（1）：36～38.