利用白腐真菌处理阿维菌素废水的研究

姚清国,杜允成,宋艳丽,赵 倩,刘显龙

(1.石家庄学院化工学院,河北石家庄050035;2.河北栾城楼底中学,河北石家庄051430)

1 引言

阿维菌素(Arem yctins简称AVM)是阿佛曼链霉菌发酵产生的各组分组成的混合物,是一种大环内酯抗生素类杀虫杀螨剂。阿维菌素作为一种新型、高效、低残留生物农药,是目前中国应用最广泛的理想抗寄生虫药,其产量迅速增长。然而在阿维菌素的生产过程中,排放大量的高浓度有机废水,主要包括生产过程中的排水、产品洗涤水、设备和车间地面的冲洗水。废水中主要成分有可溶性蛋白类、氨基酸、残糖、无机盐及微量的阿维菌素,有机物浓度高、毒性大、污染物成分复杂、难生物降解物质多、吨产品废水排放量大,在生产过程中排放的废水化学耗氧量(COD)等大大超出排放标准的要求,废水中残留的抗生素对处理废水中的曝气时的微生物有很大的杀伤性,因此,寻求优良的微生物菌种进行处理阿维菌素废水十分必要。

白腐真菌(w hite rot fungus)是一种能够引起木材白色腐朽的担子菌,它腐生在木材或树木上,使木材上出现袋装、片装或者环形的淡色海绵状团块。它能够降解其它微生物无法或很难降解的污染物。白腐真菌是木质真菌中队木质素降解能力最强的,是已知的能在纯培养中将木质素彻底降解为CO2和H2O的惟一的一类生物。

白腐菌降解污染物是依靠其分泌的木质素过氧化酶(Lip)、锰过氧化酶(M nP)和漆酶(Laccase)催化降解有机物的,其降解机理既包括生物学机制又有一般的化学物理过程,是两者有机的结合。白腐真菌上述的特殊降解机理是其降解过程具有独特的特点与优势。白腐真菌的生物降解的特点可以归纳为非专一性、非水解性和细胞外性。白腐真菌可以降解不同的化学物质,具有广谱的底物范围,对底物的结构和类型的要求是高度非特异性的;非水解性是相对其他生物大分子的分解机制而言的,木质素的结构骨架中并不存在可以水解的键,对酶的水解不发生通常的水解反应,由于木质素不溶于水,而如此巨大的分子又不能进入真菌的细胞内,所以这种生物降解只能发生在细胞外。另外白腐真菌降解木质素的主要的酶也都是在细胞外的液体或其他物质中分离出来的。选用白腐真菌法处理制药废水的关键技术是优势菌种的筛选,本文主要是研究从腐木中筛选白腐真菌菌种,希望通过测定其对阿维菌素废水的COD废水的去处能力来筛选出性能优良的菌种,用于处理阿维菌素制药废水。

2 实验材料和方法

2.1 实验材料

主要实验试剂包括葡萄糖、琼脂粉、KH2PO4、M gSO4◦7H 2O和丙三醇,均为国产分析纯。主要实验仪器包括电子天平、超净工作台、新型恒温培养振荡器、立式压力蒸汽灭菌器、磁力加热搅拌器和显微镜,均为国产仪器。

2.2 实验方法

2.2.1 分析方法

实验中各种指标的测定均按国家标准方法,其中目测观察：主要观察白腐真菌在固体培养基、液体培养基内的分布情况、生长活力、颜色等。用于表征白腐真菌的平板培养与污水处理中的生长情况。COD的测定为重铬酸盐法(GB11914-89)。

2.2.2 培养基的配制

(1)马丁氏(Martin)琼脂培养基。葡萄糖10g/L,蛋白胨 5g/L,WKH 2 PO4 1g/L,M gSO4◦7H 2O 0.5g/L,琼脂20g/L,pH值自然即可,121℃灭菌20m in,制成平板,冷却后备用。马丁氏琼脂培养基作为白腐真菌的分离培养基。

(2)PDA液体培养基。取去皮马铃薯200g,切成拇指大小的块状,加水1 000m L,电炉加热,搅拌,煮沸30min,用3层纱布将马铃薯过滤取其滤液,将滤液补足至1 000m L,加葡萄糖20g,KH2 PO4 3g,MgSO4◦7H2O 1.5g,一般 pH 值不用调节,自然达到4.5左右,溶化后分装,121℃灭菌20min,制成平板,冷却后备用。平板PDA固体培养基用于菌种的扩培。

(3)PDA液体培养基。取去皮马铃薯200g,切成拇指大小的块状,加水1 000m L,电炉加热,搅拌,煮沸30min,用3层纱布将马铃薯过滤取其滤液,将滤液补足至1 000m L,加葡萄糖20g,KH2PO43g,MgSO4◦7H 2O 1.5g,一般 pH 值不用调节,自然达到4.5左右,121℃灭菌20min,冷却后备用。PDA固体培养基用于菌种的扩培及后续处理污水。

2.2.3 白腐真菌的分离

将从石家庄郊外采集腐朽的树木刮去外表皮后,用无菌水冲洗干净,切成玉米粒大小的块状,经过紫外消毒,把剪好的材料置于75%乙醇中消毒1m in,而后用无菌水冲洗2～3次,接入已倒好的马丁氏琼脂平板培养基上,对木块进行编号。将培养皿置于27℃培养箱中倒置培养3～7d,然后放入冰箱保存。

2.2.4 白腐真菌的纯化

取切口处新长出的菌丝,及时转接至新鲜PDA固体培养基上培养。待菌落出现后,根据菌落形态、颜色的差异以及长出时间的不同,分别挑取各平板上的菌落边缘的菌丝接于新鲜PDA液体培养基上进行分离培养。培养数日后,观察菌落的形态,并作相应的记录(包括影象记录)。将相对应的菌株转至PDA液体培养基上,培养2d后,观察它们的生长情况(12h 1次),若发现不纯的菌株,从菌落边缘挑取菌丝接入新的PDA液体培养基。纯化菌株编号后,再转至PDA液体培养基上,于28℃培养箱中培养5～7d,然后放入冰箱保存。

2.2.5 白腐真菌的鉴定

菌落形态采用肉眼观察法;菌体形态采用光学显微镜观察。并依据《真菌鉴定手册》,参照其中的内容进行。

2.2.6 白腐真菌的保藏

将纯化的白腐真菌PDA液体培养基用磁力搅拌器搅拌,制成悬浮液,选择离心管,每管装0.5m L白腐真菌培养基悬浮液,再分别加入浓度为0.5m ol/L的丙三醇溶液 0.5m L,摇晃,混匀,然后放入4℃的冰箱中保藏。

2.2.7 白腐真菌处理废水

在6个250m L三角瓶中依次加入50m L废水,并标号,再分别相对应加入标号为1～6号的白腐真菌悬浮液5m L,于震荡培养箱中37℃,转速为150r/min震荡反应,于72h取水样测定COD。

2.3 结果与讨论

2.3.1 白腐真菌的分离结果

将从石家庄郊外采集腐朽的树木,处理了60个木块,每个平板内培养6个木块,板内木块培养3天、6天的形态如图1,图2所示。腐朽的木块经过6d的培养,选取木块生长最快的平板,木块底部呈现淡褐红色,木块表面布满淡色菌丝,生长旺盛,菌丝发干。依据《真菌鉴定手册》鉴定为白腐真菌。

图1 培养3d的木块

图2 培养6d的木块

2.3.2 白腐真菌的处理阿维菌素废水

按照2.2.4的方法,用PDA液体培养基进行培养。白腐真菌在液体表面生长,2d后菌丝体交结成厚度约为1mm的菌丝膜覆盖在液体培养基表面;在液体摇床震荡培养中,3d内白腐真菌萌发的菌丝在摇动作用下自发的缠绕成菌丝球。培养5d后,1～6号三角瓶内的白腐真菌生长形态大致一致,菌液呈淡黄色,菌丝聚集成球状,菌丝球直径约2～5mm,其具体差别为1、6号菌液比较浑浊,菌球大小不均匀;而2、3、4、5号菌液颜色较浅较澄清,菌球大小均匀。

2.3.3 污水处理后的结果

按照2.2.6的方法处理污水后,白腐真菌及污水的具体状况如表1。

表1 白腐真菌及污水处理后的状况

根据重铬酸盐法测阿维菌素废水原液及经过1～6号白腐真菌处理的废水的COD值,具体情况如表2。

表2 废水COD的测定结果

由表2可以看出,根据废水COD值的测定结果,2号白腐真菌处理废水的效果最好,3、4、5号处理效果仅次于2号,1、6号处理效果则略显一般。虽然最终处理结果没有达到国家废水排放标准,但是此次实验为后续研究白腐真菌处理废水的实验提供了依据,并打下了一定的基础。

4 结语

本文以白腐真菌的分离、纯化及生物降解阿维菌素废水的应用为主要研究对象,研究了白腐真菌分离、纯化的条件及对阿维菌素污水的降解能力。得到以下主要结论。

(1)马丁氏琼脂培养基中腐朽的木块经过5～7d的平板培养后呈绒毛状,菌丝布满木块表面。

(2)在PDA液体培养基中培养白腐真菌时,震荡培养加快白腐真菌的生长速度。

(3)各菌株之间存在着一定的差异,这与菌种的不同特性有关。

(4)白腐真菌可以降解阿维菌素废水,使阿维菌素废水的COD值在一定程度上可以降低,另外,废水的降解效果是与生长特性基本成正相关。

从应用前景来说,白腐真菌生物降解污染物的发展潜力很大。与传统的物理化学和生物修复方法相比,白腐真菌生物处理技术具有处理污染物范围广,操作设备简单,成本低廉,对低浓度污染物讲解效果好,降解彻底无二次污染的优点。因此研究和应用白腐真菌生物技术具有广阔的前景。

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