浅谈稀释法在五日生化需氧量测定中的应用

王敏英

（甘肃隆宇检测科技有限公司，甘肃兰州 730070）

0.引言

五日生化需氧量（BOD5）是一种用微生物代谢作用所消耗的溶解氧量来间接表示水体被有机物污染程度的一个重要指标。微生物对有机物的降解与温度有关。一般最适宜的温度是15℃～30℃；所以在测定生化需氧量时一般以20℃作为测定的标准温度。20℃时在五日生化需氧量的测定条件（氧充足，不被搅动）下，一般有机物20d才能够基本完成在第一阶段的氧化分解过程（完成过程的99%），就是说测定第一阶段的生化需氧量需要20d，这在实际工作中是难以做到的，为此又规定一个标准时间，一般以5d作为测定BOD5的标准时间，因此称为五日生化需氧量。

1.测定原理

五日生化需氧量（BOD5）测定的方法原理[1]：在规定的条件下，微生物分解水中的某些可氧化的物质，特别是分解有机物的生物化学过程消耗的溶解氧。通常情况下是指水样充满完全密闭的溶解氧瓶中，在（20±1℃）的暗处培养5d±4h，分别测定培养前、后水样中溶解氧的质量浓度，由培养前后溶解氧的质量浓度之差，计算每升样品消耗的溶解氧量，以BOD5形式表示；其单位以O2的mg/L表示。若样品的有机物含量较多，BOD5的质量浓度大于6mg/L,样品要适当稀释后测定；对不含或含微生物少的工业废水，如酸性废水、碱性废水、高温废水、冷冻保存的生活污水中微生物以正常的速度降解的有机物或含有剧毒物质，应将驯化后的微生物引入水样中进行接种，其测定方法分为稀释法与非稀释法[2]。其中，稀释法又分为稀释与接种法和非稀释接种法。

水样采集应注意事项：测定BOD5的水样采集前应先将玻璃器皿彻底洗干净。应先用洗涤剂浸泡清洗，然后用稀盐酸浸泡，最后依次用自来水、蒸馏水洗净。采集时确保水样充满并密封于瓶中，应在1℃～4℃下进行保存。在6h内经行分析。如果需要远距离转运，贮存时间不应超过24h。运输过程还要注意避免玻璃瓶之间互相碰撞，要尽量减少光照，热对样品影响时间[3]。主要使用的仪器设备见表1。

表1 仪器设备名称

2.实验步骤

实验步骤：（1）接种液的选取。接种液选取是BOD5进行质量控制的首要问题。要想获得理想的接种水就必须对接种液进行认真的科学选择。首先，未受工业废水污染的生活污水；且化学需氧量不大于300mg/L，总有机碳不大于100mg/L。接种液的来源：城市生活污水，不宜用刚排出的生活污水，必须是流动的生活污水。污水流出经过的管道要有一定的距离，污水在管道中停留时间长有利于微生物繁殖生长。其次，生活污水pH值最好在6.5～7.5范围，过酸过碱对微生物的活化不是很好，这样直接影响样品测定值的准确性。最后，微生物含量均匀有利于水样的驯化；生活污水溶解氧值的测定：在室温下放置一天，测定溶解氧值在0.1mg/L～0.5mg/L是微生物驯化最好的，是接种液的最佳选取。（2）稀释水的制备。稀释水的质量是分析好样品的前提条件。稀释水的配制一般选用新鲜，纯净的蒸馏水即可，在10L～20L玻璃瓶中装入一定量新制的蒸馏水，在使用前充分曝气6h～8h，以保证溶解氧接近饱和，溶解氧值达到8mg/L左右，临用前取其1L水分别加入氯化钙溶液、氯化铁溶液、硫酸镁溶液、磷酸盐缓冲溶液各1ml，混匀。该配制稀释水应在8h之内使用。（3）接种液的加入量接种液用量的多少直接关系到测定结果的准确性，是整个测定过程中至关重要的一个环节[4]。用量多了，5d后剩余的溶解氧值小于1mg/L，用量少了，稀释培养过程中消耗的溶解氧小于2mg/L，测定结果不可靠。

本次采用编号为(GSB07-3160-2014 200253)的有证标准物质进行分析，步骤如下：按配制要求从安瓿瓶中准确吸取20.00ml标准液移入500ml容量瓶中，用新配制的蒸馏水定容到刻线，摇匀；备用。采用上述要求选取生活污水作为接种液，其溶解氧值为0.87mg/L，化学需氧量为183mg/L，pH值：7.21，符合接种液要求。按稀释梯度每升加入1ml生活污水做接种液；用新制的蒸馏水经曝气后每升水分别加入4种营养盐水配制稀释水，测定稀释水溶解氧值为8.20mg/L；盲样分别用释稀水稀释5倍、10倍、20倍，即盲样在培养液中所占的比例为20%、10%、5%3个稀释比例按稀释接种法要求经行五日生化培养，培养前3个稀释比例溶解氧分别为8.14mg/L、l8.17mg/L、8.13mg/L，空白为8.24mg/L；在恒温20℃生化培养箱中培养5d后三个稀释比例溶解氧分别为0.71mg/L、0.79mg/L、3.60mg/L，空白为7.77mg/L。因稀释比例为20%，10%五天后其溶解氧结果小于2mg/L，是盲样测定结果不可靠；因此，该有证标准物质分析结果为81.5mg/L，在其置信范围82.3±5.9mg/L内，说明该方法适用于五日生化需氧量的测定。

不同实验员对将同批次有证标准物质进行3次重复分析,结果均在置信范围内,说明该方法可用于五日生化需氧量的测定。测定结果汇总见表2。

表2 五日生化需氧量分析记录表

经过多次测定，总结测定过程注意事项如下：

（1）水样在分析前必须将其温度恒温到20℃左右，并轻轻摇动，消除可能存在的饱和氧；使溶解氧均匀，测定结果准确；（2）水样若呈强酸性或强碱性，可加入少量氢氧化钠或稀硫酸溶液经行调节，使其pH在6～8之间；（3）分析全过程必须注意防止带入气泡，否则会造成实验误差；（4）试剂及样品移取之前一定要充分摇匀，保证有效物质的浓度均一；（5）样品培养前后溶解氧的测定应采用同一种国标方法；（6）稀释水通常要曝气，使水中溶解氧达到饱和，即8mg/L以上；（7）曝气的稀释水应在8h内使用，防止氧气逸出，加入营养盐和缓冲液以保证微生物的生长需要，尽快使用，以免玷污；（8）如果对水样的污染程度及微生物含量没有充分的把握，就应该多做几组稀释比经行比较。当水样稀释超过100倍时，应预先在容量瓶中用蒸馏水初步稀释后，再取适量经行稀释培养，正确的稀释比是培养后剩余溶解氧大于或等于2mg/L，消耗的溶解氧必须大于或等于2mg/L；（9）如果几组不同稀释比的测定结果都符合要求时，应多考虑稀释倍数小的一组；（10）数据处理过程应注意：BOD5检出限为0.5mg/L；如果BOD5的测定结果低于检出限应记为0.5mg/L；若小于100mg/L，应保留一位小数；若大于或等于100mg/L，应取整数；若大于1000mg/L，应科学计数法上报。

通过上述实验方法验证了“稀释法在五日生化需氧量测定中的应用”，进一步提高监测能力及处理数据的准确性，验证了标准方法的可行性。