考马斯亮蓝法测定分子伴侣GroEL含量及优化

盖子璇　徐宝美

摘 要：[目的]研究不同条件对测定蛋白质浓度过程中影响。[方法]以分子伴侣GroEL为研究对象，利用蛋白质与考马斯亮蓝显色原理， 测定蛋白质含量， 并对测定条件进行优化。[实验结果]：考马斯亮蓝和蛋白的复合物在595nm处有最大吸收，反应2～5min蛋白和染料结合恒定， 20℃孵育测量对实验影响较小，蛋白质含量受SDS干扰。测定所用的标准曲线方为：y=0.0144x+0.0592 。[结论]本文从多方面探究了外界因素对其影响，发现采用考马斯亮蓝测定蛋白质浓度、时间、温度、干扰剂等都是影響实验结果准确性的重要因素。

关键词：考马斯亮蓝法；蛋白质；GroEL；时间；温度；干扰剂

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2018）04-0000-00

蛋白质是生命体的基本元素 [1-2]。据前人研究，组织和细胞的更新和修补，物质代谢，生理功能的调控以及能量供应都离不开蛋白质[2]。蛋白质正确折叠才能发挥功能，错误折叠就会导致废弃蛋白质不断积累，聚集，引起许多疾病，包括阿尔兹海默症在内的若干种神经退化疾病，对蛋白质进行研究尤为重要 [3]。一般而言，生物体内新生肽链的正确折叠需要分子伴侣的辅助，GroEL便是其中具有重要研究意义的分子伴侣 [4]。

蛋白质定量测定有诸多应用，例如科研研究、临床检验、疾病诊断，准确定量对实验研究至关重要[5-6]。目前，测定蛋白含量常用的方法有紫外吸收法、凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法、考马斯亮蓝法等[7-9]。1976 年 Bradford 发明了考马斯亮蓝法（ G250）[10 -12]。考马斯亮蓝G-250染料和蛋白质结合，通过特征峰测定蛋白含量。同时，具有灵敏度高、测定快、简便等优点[11]。尽管考马斯亮蓝法有许多优点，但也有许多因素影响结果的准确性。本文以分子伴侣GroEL为待测蛋白，研究显示，温度、时间、干扰剂等对蛋白质结构均有影响[13]，可为今后科研工作中测定蛋白质浓度准确性提供建议和指导。

1 实验材料与仪器设备

（1）考马斯亮蓝G-250 购自天根生化科技有限公司。

（2）牛血清白蛋白标准液 购自天根生化科技有限公司。

（3）SDS（十二烷基硫酸钠） 称取SDS 10mg，蒸馏水定容至10ml。

（4）分子伴侣GroEL蛋白由实验室制备并保存。

2 结果与分析

2.1 测定波长的选择

取 10μL标准蛋白，140μL PBS， 2.85mL考马斯亮蓝G-250，混匀，测紫外吸收光谱， 结果如图1，染料蛋白复合物在 595nm 处有特征吸收峰。

在该波长下测定蛋白复合物准确性会比较高。

2.2 时间对吸收度的影响

取25μL1mg/ml标准蛋白，125μL PBS缓冲液，2.85mL考马斯亮蓝G-250，混匀， 测时间扫描曲线， 结果如图2所示，在 150～300s 范围内，吸光度趋于恒定。

2.3 SDS 干扰实验

（1）取6支5mLEP管，分别编号后按表 1～5 剂量依次加入标准蛋白、SDS、PBS和考马斯亮蓝试剂。见表1。

（2）混合均匀20min 后，测A595nm。

SDS，阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，还可使蛋白质分子中的二硫键还原，十二烷基部分是疏水结构，可插入蛋白质的疏水内部，这样，SDS就破坏了蛋白的疏水作用，从而破坏蛋白的三级或四级结构，引起变性。

随SDS量的增加，特征吸收值逐渐降低。加入SDS浓度为40～60uL时，混合液的595nm处的吸收峰急剧降低，呈直线下降趋势，说明SDS对蛋白的破坏程度增大了。

2.4 标准曲线的制作

按表 2取样。将溶液混合放置 2～5min后测量，记录A595nm，见表1。

2.5 温度对蛋白浓度的影响

取20μL1mg/ml标准蛋白，130μL PBS缓冲液， 2.85mL考马斯亮蓝G-250，混匀，放置10min后，分别于10℃，20℃，30℃孵育5min，10min，15min，20min，25min，30min测A595nm，结果如表3。

正常室温下同条件测的A值为0.520，放置10min后，不同孵育条件下结果显示：随孵育时间的延长，吸光度均逐渐下降。温度为10℃，与标准蛋白浓度比误差百分比达到55%。当温度为30℃，与标准蛋白浓度比误差百分比也达到55%。当温度为20℃，误差最小。由此可见，高温或低温均会影响蛋白测定的浓度。20℃是考马斯亮蓝染料的最适温度，在此条件下测定蛋白浓度表现出比较稳定的结果，但孵育时间不可过长，短时间内结果比较稳定.并与之前结果相符。

2.6 样品分子伴侣GroEL蛋白的测定

取1μL样品，149μLPBS缓冲液， 2.85mL考马斯亮蓝G-250混匀，放置 2～5min 后，测A595nm。0号试管作空白，见表4。

3结语

根据研究发现：时间、温度、干扰剂等对蛋白质浓度的测定有一定影响。根据时间影响实验，反应2～5min蛋白复合物较稳定。根据温度变化实验，可知不同温度条件下，蛋白浓度测定值都会随孵育时间的延长而逐渐降低。根据SDS干扰实验，蛋白质含量测定随SDS量的增加对蛋白影响越大。

综上所述，时间、温度、干扰剂等因素对考马斯亮蓝测定蛋白质浓度均有影响，要合理优化测定方案，可进一步提高测定的精准度，为分子伴侣GroEL的后续研究奠定良好的基础。

参考文献

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作者简介：盖子璇，女，山东威海人。