抗菌肽基因工程化研究进展

李忠强　郑伟　闫春梅　韩叶

摘 要 作为最具潜力的抗生素替代药物，抗菌肽业已成为业界研究重点。为了解决抗菌肽因产量低，生产成本高而无法大规模生产及应用的难题，研究人员适时引入了基因工程技术，人工构建抗菌肽基因，进而研发基因工程抗菌肽药物。本文分析了抗菌肽基因工程化的研究历程，为抗菌肽的深入研究及广泛应用添砖加瓦。

关键词 抗菌肽；基因工程

中图分类号 Q7 文献标识码 A 文章编号 2095-6363（2017）11-0027-02

基因工程技术在传统生产中的应用，生产高效低毒的新型抗生素是中国今后发展生物医药的重点之一。抗菌肽是生物体天然免疫的重要组成部分，是应对病原物质侵染而产生的免疫应答产物[1]，在生物体的整个防御体系中有着显著的作用。抗菌肽也是一种新型的多肽药物——一类膜活性多肽，同时具备抗霉菌、广谱杀菌、抑病毒、抑杀肿瘤细胞等多重功效。作为一种最具潜力的新型抗生素，降低成本、提高产量是对抗菌肽研究及广泛应用的基本要求。目前广大科研工作者致力于研究运用基因工程技术构建新型抗菌肽基因，再经微生物培养得到相应抗菌肽，希望最终能得到新型基因工程抗菌肽型抗生素。另外，对抗菌肽基因工程改良动物或植物的研究早已展开，目前已获得具有转抗菌肽基因动植物，均具有较高抗病性。近期研究中，由于大肠杆菌表达系统表达效率高、成本低，也成为抗菌肽基因工程表达的良好方式。

1 抗菌肽基因表达

对于基因表达，较常用的方法包括原核表达和真核表达。目前原核表达多采用大肠杆菌工程菌（E.coli）；真核表达包括酵母表达、杆状病毒表达等。针对抗菌肽基因表达研究，目前在原核表达和真核表达方面均有

开展。

1.1 原核表达

抗菌肽，因其对宿主菌E.coli有很强的杀伤力而不能直接表达[2]。目前为止，对抗菌肽的原核表达多采用先融合表达再裂解纯化的方法。早在1994年，在E.coli中将链霉素枯草杆菌蛋白酶抑制物（SSI）与蜜蜂抗菌肽apidaecin 1b（AP1）融合表达，得出了SSI-AP1融合蛋白[3]。之后，以硫氧还蛋白作为载体，融合人源抗菌肽LL-37[4]、抗菌肽ranalexin[5]在E.coli中表达，均得到高表达量蛋白。除此之外，谷胱甘肽转移酶GST和泛素相关小蛋白修饰SUMO，均可作为载体，促进抗菌肽在E.coli中进行可溶性表达[6]。另外，类固醇异构酶、PaP3.30、TAF12组蛋白折叠结构域和Purf片段等可促进抗菌肽在E.coli中进行包涵体

表达[7]。

1.2 在酵母中真核表达

采用酵母系统表达抗菌肽基因是当前应用最广泛的方法，1999年就有在酿酒酵母中表达出sarcotoxin 1A的报道，并成功检测到与成熟sarcotoxin 1A分子量相近的肽[8]。2003年，刘忠渊等利用酵母表达系统成功表达了对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抑制性的新疆家蚕抗菌肽cecropin基因，抑菌圈达1.5cm[9]。2004年，张素芳等[10]成功构建了分泌型重组酵母表达载体p PICZA-A-mag和p PICZA-A-CM，获得了类似天然抗菌肽大小的magainin及cec A-mil蛋白。两者对金黄色葡萄球菌及E.coli均有较好的抑杀性。2016年，陈骞等通过Infusion技术成功构建了pPIC9K-CAMPs和pPICZαA-CAMPs重组质粒。通过电转化将线性化pPIC9K-CAMPs转入毕赤酵母GS115基因组中，筛选高拷贝菌株GS-PK-CAMPs。再将线性化pPICZαA-CAMPs转入重组酵母GS-PK-CAMPs中，筛选出高拷贝菌株GS-PKZ-CAMPs。最终成功获得了GS-PKZ-CAMPs可诱导表达菌株[11]。

1.3 在杆状病毒中表达

利用杆状病毒表达系统表达抗菌肽也是当前抗菌肽基因工程表达研究中应用较广泛的方法。2001年，赵东红利用Bac to Bac杆状病毒表达系统在甜菜夜蛾虫体中成功表达出了中国家蚕抗菌肽人工合成类CMIV基因[12]。2008年，赵昆等在昆虫杆状病毒系统中成功表达了牛抗菌肽Bac7-Bac5-β defense串联基因，构建了重组转座载体，转化DH10 Bac大肠杆菌感受态细胞，获得重组杆状病毒穿梭载体，最终获得了具有抑菌活性的重组蛋白[13]。2013年，刘晖等也采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，成功构建了含家蝇抗菌肽attacin重组杆状病毒表达载体[14]。

2 转抗菌肽基因动物

2.1 昆虫

现阶段下，在我国国内关于转基因动物的研究已经如火如荼，如何将具有抗病性的抗菌肽基因转化到动物体内，用以提高动物体的抗病力成为国内外研究人员关注的焦点，经多年研究，业已取得了一些进展。早在1998年，Possani LD 等成功构建了一种转抗菌肽基因蚊子，利用蚊子肠道合成并分泌shiva 3抗菌肽基因，用来控制疟疾的传播，取得了一定的成效[15]。

2001年，赵东红等构建了转抗菌肽基因甜菜夜蛾幼虫，在虫体内检测到有类CMIV mRNA的存在，并在虫体血淋巴中检测到抗菌活性[12]。

2.2 鼠

在国内外，鼠类是研究转基因动物最常实验的动物模型。為了提高整合效率，在外源基因的两端加上具有隔离作用的MAR序列和微卫星序列，与染色体上的微卫星序列同源重组，已达到预期效果。可以把编码抗菌肽的基因转入到指定的细胞内表达。

董锐选用猪源抗菌肽PR39构建了表达载体pCMS-EGFP-PR39，经原核显微注射法，制备了8只F0代转PR39基因小鼠，通过人工感染猪胸膜肺炎放线杆菌，比较了转PR39基因小鼠与其同窝的野生型小鼠之间的抑菌能力差异。证明了转基因表达PR39可显著增强转基因小鼠对细菌的抵抗力[16]。

3 转抗菌肽基因植物

植物转基因的研究方法日趋成熟。抗菌肽被应用于培育抗病新品种，如抗菌烟草、水稻抗白叶枯病等。另外，抗菌肽转入植物具有明显的杀虫作用。韦鹏飞以转抗菌肽D基因的中华猕猴桃抗性芽为材料，通过诱导生根和移栽获得猕猴桃盆栽苗。对盆栽苗进行PCR和RT-PCR鉴定表明，抗菌肽D基因已经整合到猕猴桃基因组中，并进行了转录。对盆栽苗叶片中的过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性分析结果表明，在喷施猕猴桃细菌性溃疡病病原菌的条件下，转基因植株的CAT和POD活性比未转基因植株明显降低，PAL活性比未转基因植株明显升高[17]。

4 抗菌肽基因改造前景

抗菌肽基因分子量小，其表达产物容易降解，检测和纯化都有一定困难，即使融合蛋白的表达量较高，目的蛋白的表达策略也很准确，但要获取表达量较高的目的蛋白仍然非常困难。当高拷贝基因串联时，基因之间必须首尾同向相连，否则会引起质粒的不稳定，同时导致反向基因表达的蛋白错误，这将会很大程度上提高串联构建的难度性。目前，国内外学者逐步致力于从分子角度改造抗菌肽并优化抗菌肽的表达[18]。诸如氨基酸残基设计[19]、肽片段拼接设计[20]、肽链环合设计[21]、靶向设计[22]、多基因共表达[23]等。均获得了一定的科研成果，为抗菌肽基因工程化改造注入了新鲜活力。随着科学研究手段和方法的日趋完善，抗菌肽基因改造也势必迎来广阔的发展空间，为提高动植物的抗病力提供强大的科技支撑。

参考文献

[1]N. Fujitani， S. i. Kawabata， T. Osaki， Y. Kumaki， M. Demura， K. Nitta， and K. Kawano. Structure of the Antimicrobial Peptide Tachystatin A. J. Biol. Chem.， June 28，2002，277（26）：23651-23657.

[2]T. Suetake， T. Aizawa， N. Koganesawa， T. Osaki， Y. Kobashigawa， M. Demura， S. –i. Kawabata， K. Kawano， S. Tsuda and K. Nitta.Production and characterization of recombinant tachycitin， the Cys-rich chitin-binding protein.Protein Eng. Des.Sel， October 1，2002，15（9）：763-769.

[3]S. Taguchi， K. Nakagawa， M. Maeno and H. Momose.In vivo monitoring system for structure-function relationship analysis of the antibacterial peptide apidaecin.Appl Environ Microbiol. 1994，60（10）：3566-3572.

[4]Li Y F. A novel protocol for the production of recombinant LL-37 expressed as a thioredoxin fusion protein. Protein ExprPurif， 2012，81（2）：201-210

[5]Aleinein R A ， Hamoud R， Schafer H， et al. Molecular cloning and expression of ranalexin， a bioactive antimicrobial peptide from Ranacatesbeiana in Escherichia coli and assessments of its biological activities. ApplMicrobiolBiotechnol，2013，97（8）：3535-3543.

[6]祁麗，姜宁，张爱忠，等.抗菌肽研发现状及其改造策略[J].中国畜牧兽医，2016，43（2）：450-456.

[7]张学敏，金莉莉，王铮，等.抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达[J].生物工程学报，2014，30（8）：1172-1181.

[8]Aly R et al. Saccharomyces cerevisiae cell harboring the gene encoding sarcotoxin IA secrete a peptide that is toxic to plant pathogenic bacteria. Protein ExprPurif， 1999（16）：1120-1124.

[9]刘忠渊，张富春，蔡伦，等.酵母菌中表达的新疆家蚕抗菌肽（Cecropin-XJ）的特性研究[J].微生物学报，2003，43（5）：635-641.

[10]张素芳，贾赟，蔡梅红，等.Magainin和cecA-mil抗菌肽基因的密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达[J].中国生物工程杂志，2004，7（24）：93-97.

[11]陈骞，万小平，肖永乐，等.猪融合抗菌肽基因双质粒共转化重组毕赤酵母菌的构建[J].四川畜牧兽医，2016（12）：28-31.

[12]赵东红，戴祝英，周开亚，等.中国家蚕抗菌肽人工合成类CMIV基因在甜菜夜蛾虫体中的表达[J].微生物学报，2001，41（6）：680-685.

[13]赵昆，刘思国，王春来，等.牛抗菌肽Bac7-Bac5-βdefense串联基因在昆虫杆状病毒系统中的表达及其产物的活性分析[J].农业生物技术学报，2008（3）：

380-384.

[14]刘晖，王鑫，蔡辉霞，等.抗菌肽attacin重组杆状病毒表达载体构建[J].中国公共卫生，2013，12（29）：1871-1872.

[15]Possani L D et al. From noxiustoxin to Shiva-3， a peptide toxic to the sporogonic development of Plasmodium berghei.Toxicon， 1998， 36（11）：1683-1692.

[16]董銳.转抗菌肽PR39基因小鼠的制备及研究[D].广州：华南农业大学，2016.

[17]韦鹏飞，申炎龙，叶霞，等.转抗菌肽D基因中华猕猴桃的鉴定及抗病性相关酶活性研究[J].河南农业科学，2016， 5（26）：130-134.

[18]张庆华，王青，尚田田，等.抗菌肽的活性机制及其分子设计研究进展[J].中国畜牧兽医，2014，41（5）：163-167.

[19]马清泉，懂娜，曹艳萍，等.利用精氨酸和缬氨酸设计新型ɑ-螺旋抗菌肽[J].微生物学报，2011（3）：346-351.

[20]Xu X， Jin F， Yu X， et al. High-level exression of the recombinant hybrid peptide cecropinA（1-8）-magainin2（1-12） with an ubiquitin fusion partner in Escherichia coli[J]. Protein Expression and Purification， 2007， 55（1）：175-182.

[21]Chan L Y， Zhang V M， Huang Y H， et al. Cyclization of the antimicrobial peptide gomesin with native chemical ligation： Influences on stability and bioactivity[J]. Chem Bio Chem，2013，14（5）：617-624.

[22]文阳安.抗菌肽PR39靶向巨噬细胞表达抗胞内菌感染研究[D].重庆：重庆医科大学，2008.

[23]Shin J R， Lim K J， Kim Da J， et al. Display of multimeric antimicrobial peptides on the Escherichia coli cell surface and its application as whole-well antibiotics[J]. PloS One，2013，8（3）：e58997.